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灵芝三萜液态深层发酵的研究进展

2018-02-01翟双星唐庆九刘艳芳张劲松

农学学报 2018年1期
关键词:三萜类三萜菌丝体

翟双星,冯 杰,冯 娜,唐庆九,周 帅,杨 焱,刘艳芳,张劲松

(1上海市农业科学院食用菌研究所/国家食用菌工程技术研究中心/农业部南方食用菌资源利用重点实验室/国家食用菌加工分中心/上海市农业遗传育种重点开放实验室,上海201403;2上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234)

0 引言

灵芝又名瑞草、灵芝草,属多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体,是中国著名的药用真菌,最先记载于《神农本草经》,具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿、维持机体平衡等功效。已有研究表明,灵芝中含有多种活性成分,如多糖、三萜、甾醇、氨基酸、蛋白质、生物碱、挥发油、维生素及无机元素等[1]。现如今对于灵芝中的化学成分研究重点主要集中有不同生物活性的三萜和多糖的上。目前,市场上灵芝多糖相关产品种类丰富,因为灵芝中三萜成分复杂难以制备,导致灵芝三萜类的相关产品较为缺乏,因此吸引许多研究者将注意力集中到灵芝三萜化合物的研究上来。

目前,获取灵芝三萜的来源主要有两种:一是从栽培生产出的子实体和灵芝孢子中获取,二是从发酵生产出的菌丝体或发酵液中获取。由于栽培生产灵芝的周期较长(一般需要4—9个月),并且易受环境与季节的影响,导致从子实体中准备的三萜产品的稳定性较差,而通过液态发酵技术来获取灵芝菌丝体则成为制备三萜的更有效的手段[2]。目前,利用发酵法生产灵芝三萜类的文献报道有很多,主要包括菌株筛选、发酵条件优化、分离纯化、结构解析、生物活性等方面。至今未见关于这些研究的系统性总结的报道。笔者在本研究单位在过去几十年对灵芝研究的基础上,结合并总结国内外文献的研究报道报道,对发酵生产灵芝三萜的研究现状加以归类和概括,以期为后续的研究者提供借鉴和帮助。

1 灵芝三萜的种类和结构

至今为止从灵芝属中分离得到了300多种三萜类化合物。灵芝三萜类化合物是由异戊二烯单元组成的化合物[3],绝大部分属高度氧化的羊毛甾醇衍生物,包括三萜酸、三萜醇类等物质。按其碳原子数目可将其分为三大类,分别为C24、C27、C30型三萜[4];按其所含功能基团和侧链不同有15种骨架,并且其侧链长短不一,从2个碳到10个碳不等。灵芝三萜类化合物的不同骨架结构如图1所示[4]。

2 灵芝三萜的生物活性研究

灵芝三萜具有多种生理活性,主要具有保肝、抗高血压、抗HIV-1及HIV-l蛋白酶活性、抗氧化、抗肿瘤等重要作用[5-7]。Li等[8]对已受肝损伤的小鼠分别注射10 mg/kg和30 mg/kg的灵芝酸,7天后发现乙型肝炎病毒(HBV)的抑制率比对照分别提高了20%和44%。Weng等[9]研究表明富含灵芝酸的灵芝提取物可作为高侵袭性肝癌细胞肿瘤发生和转移的化学预防剂。刘冬等[10]研究表明灵芝三萜类物质对原发性高血压大鼠有显著的降压作用。郭芳等[11]测定了不同剂量的灵芝发酵液对大鼠脑组织总抗氧化活力的影响,发现灵芝发酵液1.2 g/kg可明显提高总抗氧化活力。

在过去几十年中,许多癌症患者通过使用天然产物作为替代或补充性药物,以减少或预防癌症治疗期间或治疗之后带来的副作用,从而改善其生活质量。三萜类化合物是灵芝的主要活性成分之一,对其抗肿瘤作用已有广泛研究。其中,Su等[12]测定了15个灵芝酸三萜化合物对囊肿发育的影响,结果发现灵芝酸乙酯C2在体外对囊肿的增长具有有效的抑制作用。Liu等[13]发现灵芝酸DM对PC-3细胞显示出明显的细胞毒作用。Shao等[14]研究发现灵芝酸F,灵芝酸K,灵芝酸B,灵芝酸D和灵芝酸AM1在对HeLa人宫颈癌细胞有抑制作用。

3 灵芝三萜的检测

目前,灵芝三萜最常用的测定方法主要集中在化学法和HPLC法,其中化学法主要是以齐墩果酸或熊果酸为对照品,以5%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸为显色剂,通过比色法来测定灵芝中总三萜的含量。但是由于标准品齐墩果酸与灵芝中三萜成分结构存在差异,并且灵芝中含有较多的干扰物质,导致化学法的测定结果存在比较大的误差。而相比于化学法,HPLC是一个比较精确的含量测定方法,它可以减少干扰物质对三萜含量的影响[15],但是需要对照的标准品。另外由于灵芝中三萜化合物种类丰富,且具有相似的结构特征,也导致开发准确定量灵芝三萜的HPLC色谱也存在许多困难,,导致了灵芝三萜质量标准难以提高。近年来,针对HPLC方法的困难,不同研究者开展了灵芝三萜高效液相测定方法的研究,大部分的研究主要针对灵芝子实体的三萜成分,而对菌丝体三萜成分的研究开展的比较少。贾红岩等[16]建立了同时测定灵芝子实体中12种三萜成分的高效液相色谱法。Wu等[17]通过HPLC-PAD和HPLC-MS分析了中国15个不同省份的15个样品。通过HPLC检测到47种化合物,并对其中42个化合物做出了初步鉴定。丁平等[18]建立了可同时测定6种三萜酸的含量RP-HPLC方法。总体来说,使用HPLC对灵芝三萜成分含量检测已有广泛研究,但分离效果并不够理想,或者建立的方法所测成分较少,同时,适用子实体分离的方法并不一定适用菌丝体,因此需要进一步研究。

4 灵芝三萜液态深层发酵国内研究进展

4.1 灵芝三萜生物合成途径研究

图1 灵芝三萜的基本骨架结构

三萜类化合物是灵芝合成的一种具有广泛的生理作用的化合物。目前,对于灵芝三萜的提取分离以及药理作用已有广泛的研究,而对灵芝三萜类化合物的合成代谢途径研究的较少,并且不够深入。因此,近年来对于灵芝三萜合成过程中的相关酶与相关基因也已成为研究热点。灵芝三萜化合物的合成途径现在解析如下图2[19]。

Chen等[16]研究发现,与其他萜类化合物的合成类似,灵芝三萜是由甲羟戊酸生物合成途径合成的。并通过IPP的逐渐累积,形成GPP,FPP等更高分子的异戊二烯类化合物。Lichtenthaler等[20]发现在此合成过程中IPP为异戊二烯生物合成的一个重要前体。在此合成过程中,多种酶也参与代谢,其中SQS和LSS是灵芝三萜合成的关键酶,同样地,FPPS是影响灵芝三萜前体法FPP含量的关键酶[21]。在基因表达分析结果中可以得出,HMGR与灵芝重要三萜的生物合成呈正相关[22],FPPS基因可在菌丝生长阶段表达,并且在形成原基后表达量显著提高[23]。对灵芝的全基因组进行测序得出,编码细胞色素P450的基因中有78个CYP基因与灵芝三萜重要前体羊毛甾醇的合成酶(LSS)共表达,这提示研究者CYP可能与灵芝三萜的合成有关[19]。

4.2 灵芝三萜液态深层发酵调控

目前,利用代谢调控手段提高液态深层发酵灵芝三萜的得率是现在研究的一个热点。在发酵过程中,通过选择合适的培养基,调节发酵过程的营养因子和环境因子参数,或者在发酵体系中加入外源物质等手段都可以用来影响三萜的合成代谢,达到提高灵芝三萜的得率的目的。

4.2.1 灵芝发酵培养基

(1)碳源

图2 灵芝酸的生物合成途径

灵芝液体深层发酵常用的碳源主要有葡萄糖、果糖、淀粉、玉米粉、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、酒糟等。使用复合碳源对提高发酵灵芝多糖和灵芝酸的产量有利[24]。Tang等[25]研究发现乳糖对菌体生长、灵芝酸和胞内多糖的和产生有益。鲍锐等[26]筛选出灵芝发酵产三萜的最佳碳源为玉米粉。王谦等[27]研究表明,灵芝深层培养的适宜碳源为玉米粉和葡萄糖。Wei等[28]在灵芝发酵培养中采取蔗糖分批补料方式,在10 L发酵罐残糖添加量低于15 g/L时添加蔗糖,可使菌丝体生物量、灵芝三萜产量分别提高62%、40%。

(2)氮源

氮作为构成生物体的蛋白质、核酸及其他含氮化合物的重要成分,是影响细胞生长及代谢的重要因素[29]。因此选择合适的氮源种类并确定其最佳用量对促进灵芝三萜的合成也至关重要。一般用到的氮源有酵母粉、蛋白胨、豆饼粉、麸皮、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、谷氨酸等,已有研究发现灵芝对有机氮源的利用优于无机氮源[30]。潘继红等[31]对灵芝液体培养营养需求作了探讨,筛选后得出黄豆饼粉为灵芝发酵最适氮源。Liu等[32]通过液体摇瓶发酵优化了灵芝菌株的培养基组成和发酵条件,得出最优氮源也为氮源为黄豆饼粉,这与潘继红研究一致。冯杰等[33]从硫酸铵、氯化铵、鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨和酵母粉五种氮源中筛选出酵母粉为沪农一号发酵的最优氮源[30]。

(3)无机盐

灵芝在液体发酵过程中添加少量的无机盐有利于目标产物的产生,通常Mg2+、K+和P5+是灵芝菌丝体正常生长的必要条件。其中,磷主要参与糖代谢,镁离子存在于细胞膜和细胞壁,与碳源的氧化有关。两者的用量与菌体生长有着直接的关系[34]。叶盛权等[35]在研究了K+、Mg2+和Fe2+对灵芝多糖含量的影响之后发现添加了Fe2+的发酵培养基菌丝体的生物量和多糖产量最多,分别为7.299 g/L和0.720 g/L。Xu Y N等[36]在灵芝液态培养开始时加入10 mmol/L Mn2+后发现总灵芝酸的产量提高了2.2倍。Li等[37]使用L-谷氨酰胺与CuCl综合控制策略,得出灵芝三萜的含量为1.87 mg/100 mg,比单独使用L-谷氨酰胺和CuCl提高了4.2、2.1倍。

(4)维生素

据报道,在灵芝发酵培养中添加维生素类物质可促进菌丝体的生长,其中VB1的使用最为广泛,因此诸多研究者选择添加VB1作为灵芝发酵培养基的一种生长因子来促进菌丝体的生物量和活性物质的含量,如Tang等[38]在发酵培养基中加入了0.05 g/L的VB1,朱会霞等[39]在种子培养基和发酵培养基中分别添加了1%和0.005%的VB1。并且,VB1的添加量对灵芝发酵有一定的影响,陈志玲等[40]探究了不同浓度的VB1对灵芝液体发酵的影响,下发现当VB1添加量为1.0%时,菌丝体内三萜含量达到最大,为23.56 mg/g。

4.2.2 发酵条件

(1)温度

灵芝液态发酵的温度范围在22~35℃,较高或较低温度都不利于菌丝体生长。低温时,菌丝体生长缓慢,高温时菌丝容易老化,随着时间延长菌体逐渐自溶,并且发酵液颜色加深。不同温度可影响灵芝中活性成分的产量[1]。李平作等[41]在25 L发酵罐上对灵芝发酵产三萜酸的工艺优化,得出在温度为30℃时,灵芝酸的最高产量是0.36 g/L发酵液。汪金萍等[42]研究5个不同的温度梯度,得出28℃时更适合灵芝菌丝生长。现阶段,采取变温策略控制灵芝三萜液体发酵已成为一种重要手段,本实验室研究者Feng等[43]建立了一种温度变换控制策略,分3个阶段改变发酵温度,分别实现了三萜合成水平、产量和生产率的升高,分别为27.32%,13.94%和37.11%[36]。

(2)培养基pH

pH值可影响代谢途径中各种酶的活性,是影响真菌菌丝体生长及产物分泌的重要因素。研究pH值在灵芝发酵过程中的变化规律,并通过一定方法控制发酵过程中pH值的变化,对提高灵芝发酵的灵芝酸的产量具有重要意义。Ling[39]的研究发现菌丝体生长及胞内灵芝酸生成的最适pH 5.5,胞外灵芝酸产生最适pH 4.5。刘冬等[44]认为菌丝体生长及胞内多糖产生的最适pH 5.4,胞外多糖产生的最适pH 4.6。Wang等[45]使用响应面方法优化发酵的关键条件,得出菌丝体三萜酸的最佳发酵Ph 6.0。近年来也有研究者采用分阶段调节pH值对灵芝进行发酵培养的工作报道,Tang等[46]在发酵前4天控制pH 3.0,紧接着设置为pH 4.5继续培养6天。得到灵芝酸的产量为321.6 mg/L,这比单独在pH 3.0和pH 4.5条件下分别提高了50%和300%。

(3)转速

在发酵过程中搅拌剪切力对灵芝的生长有显著影响,实验室摇床培养过程中直接控制搅拌剪切力的途径即为调节转速,赵娜等[47]在5.5 L发酵罐中发酵灵芝,采用了变转速调控策略,对振荡发酵阶段进行优化,以期达到高产三萜的目的。振荡阶段最佳条件为转速由150 r/min变为100 r/min,该策略与液体静置培养相结合,最终菌丝体三萜产量高达678.0 g/L,比优化前提高了21%。Feng等[48]开发了一种简单且可重现的两阶段转速控制来实现三萜增长的策略,即在第40 h,将搅拌速度控制在150 r/min,随后将搅拌速度控制在100 r/min,使三萜的最大浓度达到0.086 g/L,产量为6.072 g/kg,生产率为6.532×10-4g/h,相比对照组分别提高了39.61%,36.48%和49.22%。

(4)通气量

灵芝菌丝体的代谢过程需要消耗氧气。发酵中合适的通气量是确保溶解氧浓度的直接手段,不仅可使细胞在生长时有充足的氧气,而且会影响菌丝体代谢过程中各种关键酶的活性。因此在灵芝液态发酵过程中必须保证稳定而合适的溶氧环境,即稳定合适的通气量[49]。在发酵初期,菌丝量较少,可使用较低的通气量。随着菌丝生长不断加快,通气量需加,发酵后期,菌丝衰老,代谢能力减弱,通气可适当降低[1]。孙金旭等[50]使用正交实验在10 L发酵罐上寻找最优发酵工艺,发现通气量为0.4 L/(L·min)时,菌丝体干重和胞内三萜达到最大,分别为8.27 g/L和171.27 mg/L。同时,本实验室研究者在5 L发酵罐中对灵芝三萜的扩大培养条件进行优化,得出通气量为8 L/min时,三萜合成得率和生产强度最大[49]。

(5)外源添加物

近几年,采用外源添加物对灵芝三萜的生物合成进行调控成为灵芝菌丝体液态深层发酵调控的新策略和新手段。叶丽云等[51]在J-7/AL-2菌株发酵中,加入10 mmol/L钙离子诱导,三萜含量提高64%。在发酵液中加入150 μmol/L水杨酸(SA)诱导,三萜含量提高37.19%。刘高强[52]等在灵芝发酵中,加入药用昆虫蜣螂,在深层发酵第7天时,灵芝总三萜的产量达到539.0 mg/L。Ren等[53]首次使用茉莉酸甲酯作为灵芝酸的合成诱导剂,结果表明,在培养第6天向培养基中加入溶解在吐温-20的茉莉酸甲酯25 μm,灵芝酸A的产量为4.52 mg/100 mg,相比对照组提高了45.3%。Hu等[54]以灵芝生长于木材上为研究灵感,探索木材降解产物对灵芝三萜合成的影响,得出1.5%的微晶纤维素(MCC)和0.5%D-半乳糖分别可使灵芝酸的产量提高85.96%和63.90%。Feng等[48]测试了6种外源性添加剂对灵芝菌丝体生长和三萜生物合成的作用,得出在发酵第0 h加入30 mL/L的油酸可使三萜产量提高。并且分别摇瓶和5 L发酵罐中,在发酵的第25.63 h添加29.85 mL/L的正十二烷,得到灵芝三萜的浓度分别为0.85 g/L和0.88 g/L,相比对照组分别提高了578%和398%[55]。

4.2.3 灵芝菌丝体发酵动力学研究 发酵动力学研究的是发酵过程状态变量随发酵时间变化及控制变量之间的规律。它可以反映出灵芝发酵过程中菌丝生长速率、基质消耗速率和产物形成速率随时间变化规律及三者内在关系。对灵芝的发酵动力学进行研究,将有助于帮助人们进一步优化和控制发酵过程。这对三萜发酵的规模化发展意义重大。近年来,诸多研究者对灵芝发酵动力学开展了一些研究。王晓玲等[56]在30 L发酵罐中利用Sigmoid函数构建灵芝胞内和胞外三萜酸的结构动力学模型,得出菌体比生长速度、葡萄糖比消耗速率及胞内胞外比合成速率达到最大的时间。连瑞丽等[57]分别在摇瓶和发酵罐中对灵芝三萜的动力学特征进行研究,得出菌体生长符合Logistic方程。Zhang等[58]根据Logistic方程、Luedeking-Piret方程分别探究了菌体生长,多糖合成和葡萄糖消耗的动力学模型。冯杰等[59]根据Logistic方程、Luedeking-Piret方程得出得到菌丝体生长、产物灵芝三萜生成和底物总糖消耗的动力学模型和模型参数,通过专门设计的Runge-Kutta遗传算法优化了模型的动力学参数[60],并且发酵实验值与模型预测值能较好地拟合。因此,依靠国内外学者建立起来的灵芝发酵动力学模型,有助于帮助我们模拟,优化,提高灵芝三萜的生产效率。

5 展望

研究表明灵芝三萜具有广泛的生理活性,具有广阔的应用前景,现在对灵芝三萜的需求量在不断增大。因此能够摆脱自然条件限制的发酵法生产灵芝三萜的液态深层发酵技术已经越来越得到大家的关注,然而至今为止,国内外学者对发酵法生产灵芝三萜研究远远不能满足生产实际需要,这严重的制约了灵芝三萜的应用在。目前,在灵芝发酵法生产三萜的研究方面还存在以下几个方面的问题:第一,中国灵芝种质资源丰富,但未系统性的开展从灵芝种质资源中筛选适合发酵工程生产灵芝三萜菌株的工作。第二,现有的研究主要集中于灵芝子实体三萜化合物的研究方面,对菌丝体中的三萜的化学结构和药理活性方面的研究仍然缺乏。第三,基于发酵工程生产灵芝三萜的研究多集中于实验室规模,规模化的利用发酵法生产灵芝三萜的工艺研究的仍然较少。第四,灵芝三萜发酵工艺优化时,以生物量和活性成分作为判断标准的工作比较多,而直接利用活性追踪的方法优化生产工艺的工作尚不多见。因此,需要加强以上4个方面的工作,对以使利用发酵工程的方法生产灵芝三萜的技术可以真正用于实际生产中,以解决灵芝三萜难以大量的持续性获得难题,为利用灵芝三萜开发保健品和药品、打下良好的技术基础。

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