生物材料在胰岛移植中的研究进展

2018-01-31王肖扬程颖中国医科大学第一附属医院肝胆外科辽宁沈阳110000

实用器官移植电子杂志 2018年6期

王肖扬，程颖（中国医科大学第一附属医院肝胆外科，辽宁沈阳 110000）

糖尿病是当前威胁人类健康的最重要的代谢性疾病之一。1型糖尿病是由胰岛β细胞被破坏而引起的自身免疫性疾病［1］。目前尚无有效的药物治愈糖尿病，而对于某些患者，同种异体胰岛移植被认为是一种可行的治疗方法。随着埃德蒙顿方案的发展已经取得了显著的改善，但由于大多数受者最终逆转为胰岛素替代治疗，长期胰岛素独立仍有待深入研究［2-3］。胰岛移植缺乏长期的治疗效果，主要是由于移植后功能性胰岛早期耗竭，继而使得胰岛功能和活力逐渐下降。其主要原因可能是［4］：① 胰岛暴露于门静脉，会引发立即血液介导的炎症反应，循环血液中产生自身抗体；② 肝脏中胰岛移植部位的缺血和纤维化；③ 患者需终身使用免疫抑制剂。近年来，如何减轻胰岛损伤，提高胰岛移植效果是目前研究的重点。胰岛损伤最主要原因是缺血缺氧以及炎症反应。改善血氧环境及免疫隔离是有效的办法。而随着生物材料与医学研究越来越紧密，将生物材料应用到胰岛移植具有不错的前景。主要体现在两个方面：① 隔离，制造免疫隔离区；② 支架，创造出适宜的生理环境。隔离主要包括微囊化及保形涂层。目前研究较多且较成熟的胶囊胰岛封装技术解决了免疫排斥的问题。海藻酸盐是胰岛包裹最常用的生物材料，生成海藻酸盐-胰岛微胶囊，平均外径为400 ～ 800 μm。但治疗效果并不理想，因为它超过了氧气的生理扩散距离。有报道称使用藻酸盐包裹的胰岛移植的临床试验不理想，患者接受输注藻酸盐包裹的胰岛均未能实现胰岛素独立性，这归因于藻酸盐的化学不稳定性，炎症相关的纤维化和血管形成不足导致胰岛死亡［5］。保形涂层几乎不改变胰岛体积。已报道胰岛的聚乙二醇化、四氟乙烯或硅膜纳米囊封显示胰岛细胞存活时间延长［5］。另一种方法使用工程化的聚合物支架来创建人工定制的胰岛移植位点。生物材料可以包裹细胞，人为制造出天然微环境，以生理方式释放治疗药物、通过递呈物质引导细胞定向生长和增殖［6］。在移植早期，胰岛的存活率依赖再血管化的时间和程度，所以提前对多孔支架进行再血管化处理对胰岛移植的帮助不容小觑。可以利用多孔支架在胰岛内重建血管系统。本文主要介绍生物材料在胰岛移植的应用以及对其前景进行展望。

1 胰岛隔离

胰岛隔离主要包括微囊化以及保形涂层。但近年来微囊化的处理效果并不理想，临床实验结果也表明胰岛长期独立性是不可能的。与微囊相比，保形涂层效果相对良好，它几乎不改变胰岛体积，肝素星形聚乙二醇保形涂层就是其中之一。聚乙二醇无毒，无刺激性，具有良好的亲水性，生物相容性和控缓释性能，其作为生物材料应用到保形涂层上很合适。由星形聚乙二醇组成的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）具有良好的生物相容性和多功能性，可以用来模拟纳米薄膜。此外，肝素也因其抗炎、抗凝血特性和通过招募促血管生长因子促进胰岛血管化的能力而被纳入到星形聚乙二醇纳米薄膜中，肝素通过N-羟基琥珀酰亚胺基与胰岛表面膜的胺基共价结合。肝素星形聚乙二醇纳米涂层对培养的胰岛体积产生极小的改变［7］。通过评估包被胰岛的活力和功能来评价肝素星形聚乙二醇纳米涂层的稳定性和功效。实验结果表明肝素星形聚乙二醇包裹的胰岛表现出强大的胰岛细胞活力，功能不受影响。更重要的是，肝素使纳米涂层还减少即时血液介导的炎症反应，同时促进胰岛在促炎环境中的存活，两者都有利于改善临床细胞治疗的治疗效果［7］。炎症反应和氧气供应是胰岛死亡的主要原因，而保形涂层在这两方面效果不错，临床效果良好。肝素星形聚乙二醇纳米膜代表了用于细胞表面工程的可行方法，这将改善细胞治疗的临床结果。

2 支架

支架胰岛定植移植技术主要是通过高分子材料制作3D多孔支架为胰岛创造一个适宜的生理环境。聚合物支架作为胰岛移植理想载体应该具备以下特点［8］：① 不干扰胰岛的功能和活力；② 支持快速的血运重建；③ 只触发轻微的甚至不触发免疫系统激活；④ 具有与机体组织和外科植入操作相适应的机械性能等。

在植入胰岛前一般会对支架做再血管化处理，有效的提高胰岛存活。由于每个胰岛细胞的平均直径为100 ～ 150 μm，支架孔径大小将影响胰岛细胞再血管化及存活情况，但普通高分子材料支架并不能精确控制孔径大小，因此，随着3D打印技术的兴起以及精度的提高，把3D打印应用到胰岛定植移植效果值得深入研究。

胰岛虽然只占总胰腺质量的2%～3%，但其需要胰腺10%～20%的血液供应，有利于氧气、营养素、胰岛激素及其他细胞效应物的快速交换。在临床胰岛移植前的分离过程中，维持胰岛血管化和神经支配所必需的ECM常常由于酶消化而受损，导致胰岛微血管被破坏，胰岛功能和存活受损［9-10］。大孔支架已被广泛用作细胞治疗的临时人工ECM，通过为细胞容纳、随后的增殖和分化提供一个最佳的位点。由于3D和高度多孔结构，其促进营养物交换、细胞浸润和体内血运重建［9-10］。同时在移植早期，胰岛的存活率依赖于再血管化的时间和程度。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种与血管生长有关的特异性细胞因子，在胰岛移植的部位造成局部的高VEGF环境，诱导移植胰岛再血管化，改善微循环，降低移植胰岛的早期病死率。VEGF也称血管通透因子（vascular permeability factor，VPF）或促血管因子，是目前最有效、直接作用的血管生成素蛋白，是一种可扩散的内皮细胞特异性有丝分裂素和血管生长因子。在病理和生理的血管生成中都是必不可少的诱导因子，具有特异性强、作用确切的特点。可高效特异地作用于血管内皮细胞，有强烈的促分裂和趋化作用，并可增强微血管通透性，促进血浆纤维蛋白外渗，为血管形成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网络［11］。可以通过内皮细胞上的两个特殊受体flt和flk（KDR）作用，直接刺激内皮细胞增殖，并产生纤维蛋白溶酶原激活剂和胶原酶，促进内皮细胞移动和血管生成［12］。组织受到缺血、缺氧刺激时，内源性VEGF表达会增加，但内皮细胞的完整性不能迅速恢复。这在移植胰岛中也得到了证明［13］。因此需要额外加入外源性VEGF来促进再血管化。实验利用基因转染技术，以VEGF为目的基以血管内皮细胞作为“中介细胞”，使移植局部形成高浓度的VEGF，为新生血管的形成创造良好的微环境，诱导移植组织再血管化［14］。本实验表明，单纯接受胰岛移植的大鼠，虽然术后血糖有所下降，但未降到正常水平，证明移植的胰岛存在死亡现象。病理学观察也证实在胰岛中心的β细胞已经被大量结缔组织代替，仅有少量细胞残留，被抗胰岛素抗体染成棕黄色。经转染的大鼠血管内皮细胞于移植后14 d内局部仍能表达较高浓度的VEGF，同时CD34免疫组织化学染色显示，实验组移植胰岛的内皮细胞明显增多，出现明显的血窦，且移植胰岛的功能及胰岛素分泌水平恢复正常，说明因为缺血、缺氧而导致移植胰岛早期死亡的现象得到改善，死亡数量减少，从而使供胰需求量明显减少。ECM是由蛋白质和多糖组成的动态结构支架，现在已被公认其对于胰岛功能和存活至关重要，其在分离过程中被破坏受损，将对血运重建和移植后功能不良产生重要影响。肝素是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，存在于ECM中，有抗凝血特性和通过募集促血管生成生长因子促进胰岛血管形成的能力［15-17］，可通过稳定VEGF和其他生长因子来增强胰岛血管生成［16］，同时抑制局部炎症反应［17］。我们可以将其应用到高分子材料上来进行再血管化处理。因此将VEGF、肝素与支架结合做再血管化处理能近一步改善胰岛缺血缺氧环境。

支架材料目前主要有天然高分子材料支架、人工高分子材料支架、人工-天然复合材料支架及3D生物打印支架等。本文重点介绍天然高分子材料支架和3D打印支架。

2.1 天然高分子材料支架：天然的高分子材料及其降解产物因具有良好的生物相容性和低免疫原性，可用做制作多孔支架。丝素蛋白（silk fibroin，SF）是来源于家蚕的一种天然结构蛋白，具有生物降解性及低免疫原性，在组织工程的各个方面，优于常规合成和其他天然生物材料［18-22］。事实上，据报道，通过基于SF的水凝胶将胰岛与间质干细胞（ mesenchymal stem cell，MSC）和ECM的两种成分（层粘连蛋白和胶原蛋白Ⅳ）共包封，在体外观察胰岛存活时间延长且功能增强［23］。此外，掺入内皮细胞结合基序的SF基质也被证明可以促进MIN6 b细胞或人类内分泌细胞的假胰岛形成［24］。之前也提到了肝素对胰岛再血管化的作用，把肝素和SF支架结合起来可能效果会更好。Mao等［25］研究了丝素蛋白大孔支架在糖尿病小鼠同种胰岛移植中的治疗潜力。肝素释放SF支架（H-SF）的性能优于SF支架，这种优越的移植结果归因于H-SF促进胰岛血管化和细胞增殖，伴随VEGF上调，胰岛内血管重建也更明显。此外，当H-SF与从VEGFR2-luc转基因小鼠体内提取的胰岛共移植时，收集对应于VEGFR2表达的生物发光信号持续升高，暗示肝素激活内源性VEGF/VEGFR2通路，促进胰岛血运重建和细胞增殖。虽然肝素丝素蛋白支架还鲜有运用到临床上，但其前景还是不容小觑。而且肝素和丝素蛋白都有应用到临床的例子。

2.2 3D打印支架：随着3D打印技术的兴起以及精度的提高，把3D打印应用到胰岛移植的前景良好。3D打印技术（three-dimensional printing，3DP），又名快速成型、实体自由成型、增材制造等，是基于离散堆积原理，在计算机辅助下通过层层堆积形成三维实体，有别于传统减材制造的先进制造方法［26］。因高精度、个性化制造及复杂形状构建上的独特显著优势，3D打印渗入了各行各业并引领创新，引发全球制造业产生革命性变革［27-30］。它涵盖了一系列自动化技术，能够对包含活细胞、生物材料和生物活性分子的结构进行空间组装。生物打印机和生物墨水是生物打印的两大关键要素。3D打印的材料往往具有支撑细胞和三维组织结构的作用。针对特定的组织类型，从皮肤、肌肉、软骨、硬骨，材料打印必须具有不同的力学强度和微结构，尤其是材料的孔径。比如丙交酯是生产聚乳酸（polylactic acid，PLA）的原料，是一种生物来源的化学品。而PLA是一种半结晶型聚合物，具有优异的可加工性能，可用于熔融沉积3D打印技术。另外，PLA具有可降解性能和生物相容性，并且PLA的生物毒性较低，能够用于组织工程、医疗器械等3D打印产品的生产。唐通鸣等［31］制备了一种PLA材料，并对其性能进行了测试，测试结果表明，PLA 材料的熔点为130.65℃，熔体流动速率为 9.58 g/（10 min），拉伸强度为 63.2 MPa。由于该PLA材料的流动性能和力学性能均较为优异，所以将其应用于熔融沉积 3D打印技术时，材料易成丝并且打印过程中不易发生断丝现象。由于每个胰岛细胞的平均直径为100～150 μm，支架孔径大小将影响胰岛细胞再血管化及存活情况。生物打印的胰岛支架通过将胰岛营养因子纳入墨水以使先前不适宜的位点支持胰岛生长，开发胰岛移植新替代位点的潜力。将缓释化合物掺入印刷油墨配方中为促进胰岛存活和植入提供了潜在的新途径。这些方法包括促血管生成因子的局部表达，例如VEGF和肝细胞生长因子［32-33］和抗凋亡因子，如胰岛素样生长因子-Ⅱ［34-35］可以在墨水里专门提供。最后，可以用免疫抑制或免疫调节因子修饰墨水以防止排斥。有实验使用PLA作为3D打印材料，结合VEGF设计的3D打印支架，通过对支架预血管化处理后移植于裸鼠皮下，再对支架的再血管化和胰岛活性检测，结果表明皮下植入3D支架能迅速产生且足量的移植物血管。