移植免疫与器官再生的研究进展

刘泉，齐忠权（.哈尔滨医科大学附属第二医院硬组织发育与再生实验室，黑龙江哈尔滨 50086；2.广西大学医学院，广西壮族自治区 南宁 530004；3.厦门大学医学院，福建 厦门 3602）

在临床移植手术和免疫抑制取得巨大成功后的数十年间，同种移植免疫领域堪称突破的进展较少。异种移植由于排斥和感染等障碍举步维艰，令很多研究者失去兴趣。器官再生研究尽管方兴未艾，但距离解决人类的实际问题还有相当长的路要走。近年来，随着干细胞技术和基因编辑技术的发展，移植与再生领域取得了巨大发展。在此，我们对科学意义和应用前景较为突出的进展加以评述，挂一漏万乃至谬误之处，恳请同行指正。

近年来，移植领域令人瞩目的进展之一是异种移植的“复兴”，使异种移植真正成为了器官移植的未来［1］。这主要归功于基因修饰技术，特别是CRISPR/Cas技术的发展。一方面，基因修饰技术可消除供者异种抗原表达，并使供者细胞表达保护性分子。例如，基因修饰猪-非人灵长类生命支持性肾移植后，已实现受者长期存活［2-3］。基因修饰猪-狒狒异位心脏移植，采用αCD40单抗为基础的免疫抑制治疗，实现了移植物长期存活［4］。由于尚未有异种原位心脏移植长期存活的动物实验，在开展临床试验之前，应证明异种原位心脏移植能够较长时间发挥生命支持作用；另一方面，通过CRISPR/Cas9技术灭活猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）是异种移植近年的重要突破。尽管外源性病毒可以在猪的饲养繁殖过程中通过各种手段加以清除，但PERV整合在猪的基因组中，缺乏有效的清除方法。Yang等［5］采用CRISPR/Cas9 技术破坏了PK15细胞（一种猪胚胎肾细胞系）基因组内62个PERV pol基因的高度保守区域，从而使PK15细胞丧失了令HEK 293细胞（一种人胚胎肾细胞系）感染PERV的能力。继而，研究人员证明了PERV可以从猪细胞传播至人细胞，并可在人细胞之间相互传播［6］。更重要的是，研究人员采用CRISPR/Cas9技术灭活了猪胚胎原代成纤维细胞的PERV，并通过体细胞核转移获得猪胚胎，最终得到了全基因组灭活PERV的健康仔猪［6］。尽管异种移植还有诸如免疫排斥及生理相容性等问题需要解决，这两项研究成果无疑对提高异种移植的安全性具有重要的意义，使异种移植向临床应用迈进了一大步。

在同种移植领域，有两项值得关注的进展。第一个是遗传学在临床同种移植中的应用。移植排斥从根本上讲是由于供者和受者之间基因，特别是人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因的不同。近年来，随着二代测序（next-generation sequencing，NGS）准确率和效率的提高以及成本的下降，采用NGS进行HLA分型将成为未来的发展趋势［7-8］。全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）作为发掘遗传因素对表型影响的有力工具，在移植排斥、免疫抑制药代动力学和移植后新发糖尿病等方面得到一定应用［9-12］。供者表观遗传学特征如DNA甲基化和组蛋白的修饰，已被证明与缺血/再灌注损伤和移植物存活相关［13］。受者表观遗传学特征对移植排斥、免疫抑制治疗及其诱发疾病等方面影响的研究多围绕基因如FOXP3的DNA去甲基化，为早期诊断提供线索［13-15］；第二个进展来自同种移植抗原递呈途径的研究。“序贯三细胞”模型，即T辅助细胞 （T helper cells，Th） -树突状细胞（dendritic cells，DC）-细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells，CTL），是CTL识别抗原、接受辅助并活化的途径［16-18］。然而，移植领域既往的研究认为，受者间接途径特异性Th与受者DC在二级淋巴器官内相互作用，而受者直接途径CTL只能识别移植物细胞上的抗原，这样的“四细胞”模型显然与“三细胞”模型相悖。研究人员为解决这个问题提出了半直接途径的概念［19］，但缺乏物质基础和器官移植实验的证明。近来有体内实验数据支持半直接途径在移植排斥中的重要作用，即完整的供者MHC-肽复合物转运至受者DC从而激活受者的CD4和CTL，而非供者DC直接接触活化受者T细胞［20-22］。供者MHC-肽复合物以供者DC产生的外泌体为载体进行转运［20-21］，也有研究认为前者可来源于移植物实质细胞［22］。以上进展为诊治同种移植排斥反应提供了新思路。

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）曾为器官再生带来希望［23］。然而，通过iPSC在体外构建实体脏器的研究进展非常缓慢［24］。物种间嵌合体的应用打破了这个困境［25］，成为近年来器官再生领域的亮点之一，有望产生来自患者自身细胞的器官用于移植［24］。通过构建人-动物嵌合体获得人的器官，首先要通过基因修饰去除动物体内的特定器官，从而为人器官发育提供所需的“巢”。然后将人的多能干细胞（pluripotent stem cell，PSC）引入动物早期胚胎内发育为嵌合体。发育成熟后，获取人的器官。目前已知，物种之间进化距离近的容易获得嵌合体，如小鼠与大鼠之间。已经实现将小鼠-大鼠嵌合获得的小鼠胰腺细胞，用于治疗同品系小鼠链脲霉素（streptozocin，STZ）诱导的糖尿病［26］。进化距离远的较难构建嵌合体，如人和猪之间。研究人员采用不同状态的人PSC初步验证了人-猪嵌合的总体水平，但是嵌合率只有1/100000［27］。而化学方法处理的人PSC能够使人-小鼠嵌合率达到1/100［28］。这种PSC在人-猪嵌合实验中的表现值得期待。结合前述灭活PERV猪的进展，在不远的将来人-猪嵌合体有望成为移植器官的重要来源。当然，前提是人-动物嵌合的伦理问题得到妥善解决。

数十年科技、临床和制造业发展成果的累积正在拉开新一轮科技革命的大幕。移植和再生领域的革命性进步也同样呼之欲出。我国科技、临床工作者与企业应当紧密合作，奋力抓住这次机遇，从科学研究、技术研发、应用转化和产业化等角度占领制高点。此外，可以预见的是，异种或人-动物嵌合体来源组织器官的应用将会引起医学伦理、政策法规和社会共识等方面的问题与争论。我国科技和医药卫生行政主管部门应引导扫清这些障碍，造福人类。