间充质干细胞促进肝再生的研究进展

2018-01-31侯宾宋红丽沈中阳天津医科大学一中心临床学院天津300070天津市第一中心医院器官移植中心天津市器官移植重点实验室天津3009

实用器官移植电子杂志 2018年2期

侯宾，宋红丽，沈中阳（. 天津医科大学一中心临床学院，天津 300070；. 天津市第一中心医院器官移植中心，天津市器官移植重点实验室，天津 3009）

肝脏发源于胚胎内胚层［1］，成体以后，肝脏修复、再生可通过3个途径完成：① 通常肝组织成熟肝细胞经过有丝分裂，使肝脏体积和功能得到恢复；② 当肝脏严重受损时，可激活卵圆细胞增殖、分化为肝细胞和胆管上皮细胞；③ 通过骨髓干细胞的参与，骨髓干细胞是肝细胞的重要肝外来源，在特定环境下可分化成肝干细胞及肝细胞，从而参与肝功能的修复和重构［2］。干细胞分为造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）和间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）。

MSC是干细胞家族的重要成员，是从间充质组织如骨髓（bone mesenchymal，BM）、脂肪组织、脐带和牙髓中收集的成纤维细胞样、平板附着细胞，具有自我更新和从不同胚层分化为成体细胞的能力［3-7］。第一次报道MSC时提及，在细胞因子混合物存在的情况下骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell，BMSC）能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞［8］。研究显示，来自几乎所有部位的间充质组织的MSC都可以通过基因导入或细胞因子诱导分化成3个胚层的细胞。例如，MSC在体外能够分化成内皮细胞［9］、心肌细胞［10］、骨骼肌细胞［11］、肝细胞［12］、神经元细胞、上皮细胞、外周神经胶质细胞和胰岛素分泌细胞等［13］。MSC可以通过分泌细胞因子［14-17］、细胞融合［18］转分化为肝细胞［14，16，18-19］以及通过微泡和细胞物质的转移［20］等机制来减少炎症和免疫反应，刺激肝细胞增殖和肝内血管生成、抑制肝细胞调亡等形式促进肝再生［14，18-19，21-25］。本文主要从免疫、细胞因子、转分化及载基因等方面概述MSC促进肝再生的研究。

1 MSC通过免疫介导促进肝再生

MSC可以潜在地与多种免疫细胞相互作用促进干细胞再生，包括作用巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞（dendritic cell，DC）等［26］。

1.1 巨噬细胞介导的肝再生途径：MSC能够激活巨噬细胞分泌集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素 - 6（interleukin 6，IL-6）［22］。而巨噬细胞消耗实验证实，巨噬细胞耗竭的情况下，肝损伤小鼠肝脏的再生率受到极大的损害，表明巨噬细胞可能参与肝再生［27］。由此可以推断，MSC能够通过巨噬细胞为肝细胞增殖提供初始启动力，从而促进肝再生［17，28］。

1.2 NK细胞介导的肝再生途径：使用聚肌苷-聚胞苷酸（polyinosinic-polycytidylic acid，Poly I-C）激活NK细胞时，肝脏再生功能受到影响，而减少NK细胞可以增加肝脏再生率，表明NK细胞可能参与肝再生［27］。在γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）抵抗的小鼠中，IFN-γ对肝再生的阻滞作用被认为是由肝细胞中的抗增殖蛋白如STAT1、IRF-1和p21cip1/waf1介导［29］。这说明肝脏NK细胞的作用是抑制而不是促进肝脏再生，这种抑制作用很可能是通过NK细胞分泌的IFN-γ介导的［30-31］。研究发现，MSC与NK细胞在体外能够相互作用，当静息的NK细胞被活化，白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）激活，其表面受体表达水平增加。而MSC能够抑制NK细胞表面的主要活化受体，进一步对NK细胞达到抑制作用［27-28］。因此，通过减少NK细胞，MSC能促进肝再生［32-33］。

1.3 DC介导的肝再生途径：DC在肝脏内分布较稀疏，但在肝损伤后，肝脏DC数量急剧增加，表明这些细胞在肝再生过程中可能起作用［34］。同时在部分肝切除动物模型中，刺激DC可以促进白细胞介素-10（interleukin -10，IL-10）的产生，增强雌激素受体的表达，作用于免疫系统，调节局部炎症反应。同时DC也可以抑制T细胞的产生，降低炎症水平，并通过NK细胞介导的肝再生途径，发挥生物学作用，从而促进肝再生［34-35］。MSC能够刺激受损肝脏内的DC生成，降低炎症反应，从而促进肝细胞增殖［36］。

1.4 其他免疫因素介导的肝再生途径：除了以上途径，MSC受到炎性细胞因子的影响时，能够趋化性迁移到发炎的组织，并通过其在先天性免疫以及适应性免疫两个水平上调节局部炎症反应［31，37-39］。当病原体入侵人体后，机体防御机制可以分为先天性和适应性免疫。

先天性免疫主要依靠巨噬细胞、DC和NK细胞等作为其细胞效应物，通过先天模式识别受体（innate pattern recognition receptors，PRR）识别病原体，从而快速激活机体防御机制（包括细胞因子和趋化因子的产生、吞噬作用和其他抗微生物杀伤机制），呈递抗原至适应性免疫系统。而适应性免疫系统由T淋巴细胞和B淋巴细胞组成，识别特异性抗原，从而诱导记忆细胞，产生免疫反应［40］。

在先天性免疫方面，MSC通过局部分泌某种介质直接抑制MSC附近免疫细胞的增殖，同时通过影响前列腺素和生长因子（如血管内皮生长因子、角质形成细胞生长因子和肝细胞生长因子等）的分泌，间接影响免疫调节和修复［41］。在适应性免疫方面，MSC则可以通过抗炎Th-2免疫激活，或在IL-10影响下直接诱导调节性T细胞产生，降低炎症反应［42］。

总之，通过上述途径，MSC能够通过刺激巨噬细胞和DC生成，降低NK细胞，减少NK细胞的增殖，减少肝损伤部位的炎症反应，促进肝再生［36］。

2 MSC通过信号传导促进肝再生

MSC可以通过旁分泌信号途径释放各种细胞因子，调节炎症和免疫反应，减少肝损伤，刺激肝细胞增殖，从而促进肝再生［14-17］。MSC具有分化为多种细胞类型的潜力，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，这些细胞能够分泌肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）。通过小鼠敲除实验发现，HGF结合酪氨酸激酶受体（cMET受体）后，通过三种信号传导通路，包括ERK1/2、p38-MAPK和PI3K/Akt通路，启动细胞信号传导，在肝组织再生、发育和增殖中起作用［43］。

2.1 Ras-ERK1/2介导的信号传导通路：研究证明，Ras依赖的细胞外信号调节激酶（Ras-ERK1/2）途径受到HGF / cMET的影响，主要通过促进有丝分裂发生作用，促进细胞增殖［44］。

2.2 P38/MAPK 介导的信号传导通路：HGF与cMET受体的结合启动小膜连接的GTP酶Ras的活化。激活Ras能够进一步激活Raf，后者可以诱导丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase，MAPK/MEK）的活性。通过MEK3 / 63的信号级联反应能够磷酸化p38，后者被认为是涉及应激反应的促分裂原活化蛋白激酶［45］。由此可见，P38/MAPK可以指导肝细胞应答，促进肝细胞生成。

2.3 PI3K/Akt介导的信号传导通路：磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）与蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）结合形成PI3K/Akt通路。Akt的作用是通过增加细胞存活因子防止细胞调亡。在HGF与cMET受体结合以及随后的受体二聚化和自体磷酸化之后，被激活的受体募集信号分子Gab-1，其与PI3K相关联。与PI3K的缔合引发磷脂酰肌醇3，4-磷酸（phosphatidylinositol 3，4-biphosphate ，PIP2）和磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3）的产生，并进一步产生第二信使肌醇三磷酸（inositol triphosphate，IP3），从而发挥生物学效应。因此，PI3K/Akt介导的信号传导通路能够作用于肝细胞再生周期的调节［45-46］。

HGF/cMET系统可以通过以上3种通路，引起下游信号级联反应，其通过多种途径发挥作用从而产生生物效应，促进肝细胞增殖。再生完成后cMET被泛素化并降解，从而阻止HGF/cMET的恒定信号，阻断其信号通路。而当HGF信号途径中断时，肝脏的尺寸较小并且呈现广泛的细胞死亡［47］。且研究表明HGF过表达的MSC有助于肝细胞再生。综上所述，HGF可以通过上述3条信号传导通路的激活，调节肝细胞生长、存活、运动、迁移、有丝分裂，并且在肝再生中发挥重要的作用。

此外，MSC通过旁分泌方式，能够调节SDF-1 / CX趋化因子，释放其他细胞因子，如胰岛素样生长因子（insulin like growth factors-1，IGF-1）、基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）和CXC趋化性细胞因子受体-4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR-4）轴［48-49］。其中IGF-1是人体代谢的重要因子，使用过量表达IGF-1的重组腺病毒能够增加肝脏中HGF的分泌，减少肝细胞调亡并促进小鼠肝细胞增殖，改善小鼠的肝损伤。同时，BM衍生的AdIGF-I-MSC在肝脏中的应用可以导致IGF-I和HGF表达增加，减少肝细胞损伤，促进肝再生［50-51］。MSC的旁分泌信号中还存在一种被称为外泌体的重要信使，能够诱导肝细胞转变为肝卵圆细胞，加速肝脏再生，减少肝损伤［52］。

3 MSC通过直接转分化促进肝再生

3.1 MSC转分化的细胞学基础：研究表明，MSC能够直接转分化为肝细胞，促进肝再生［14，16，18-19］。在对MSC促进肝再生的机制研究过程中发现了一种独特的细胞，被命名为多系分化持续应激细胞（multilineage differentiating stress enduring cell，Muse）［4，53］。Muse 细胞具有不易癌变、自我再生的特点。在重症联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠的暴发性肝炎模型中，Muse细胞通过血管渗透到受损的肝脏，与肝细胞整合后可以自发分化成肝细胞，并促进肝脏组织修复。与其他干细胞相比，Muse细胞的独特之处在于Muse细胞是导入到体内后自发分化成类似于功能性人类肝细胞的细胞，而不是在导入前被诱导成肝细胞［54］。此外，Muse细胞在早期阶段也可以作为肝干细胞进行整合，在肝部分切除模型中自发分化为肝细胞、胆管细胞、窦状内皮细胞和库普弗细胞等主要的肝脏成分，修复广泛损伤的组织和器官从而参与肝再生［54］。重要的是，MSC以外的其他细胞不具有这些多能属性。这表明Muse细胞可能参与MSC的转分化途径［54-55］。

3.2 促进MSC转分化作用：研究证实，Wnt /β-连环蛋白信号传导途径在调节人类MSC参与的肝细胞分化中起重要作用［56］。在Wnt信号传导激活后，β-连环蛋白将转位进入细胞核并共同激活下游转录因子从而调节MSC的分化。此外，间充质-上皮转变和相反的上皮-间充质转变以及表观遗传修饰（如DNA甲基化和组蛋白乙酰化）也在MSC向肝细胞分化中起重要作用［36，55，57］。上述途径最终都将参与MSC的分化，促进MSC向肝细胞转变，从而诱导肝再生。

4 MSC通过载入基因促进肝再生

MSC可作为一种转基因载体，携带某种促进肝细胞再生的基因进入受体，并且使该基因能够在受体内持续稳定表达发挥作用［58］。

MicroRNA-27b是位于C9orf3基因9q22.1染色体上的基因内微小RNA，参与影响血管生成、细胞增殖、转移等多种生物学过程［55］。有实验证明，MicroRNA-27b转染脂肪来源MSC（adiposederived stem cell，ASC）后，能够通过以下途径提高ASC的肝再生能力［59］。在基因水平上，MicroRNA-27b能够促进ASC中血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表达。HO-1不仅直接增加ASC对HGF的分泌，刺激肝细胞增殖，而且介导IL-1受体拮抗剂（interleukin -1 receptor antagonist ，IL-1Ra）和成纤维细胞生长因子-21（fibroblast growth factor-21，FGF-21）的分泌。而IL-1Ra和FGF-21则是肝脏损伤后肝脏再生和保护的重要因子。此外，PGC-1α能够促进ASC分泌抗炎和细胞保护因子，通过旁分泌途径发挥作用。因此，转染MicroRNA-27b的ASCs能够增强抗炎、保护肝脏，促进肝再生。另一个已知的细胞调亡抑制基因（B cell lymphoma-2，bcl-2）基因，能够激活肝星状细胞，改善肝纤维化［57，60］。研究表明，过表达bcl-2基因的BMSC能促进肝细胞样细胞的分化，促进肝硬化大鼠肝功能的恢复［51］。由此可见，过表达bcl-2基因的BMSC在促进肝再生方面也有着应用前景。