苦参碱和氧化苦参碱体内外模型的肝毒性比较研究
2018-01-31郭秋平陈贵英金若敏
郭秋平,陈贵英,周 泉,金若敏
(1.广州医药研究总院有限公司药物非临床评价研究中心,广州 510240; 2.上海中医药大学药物安全性评价中心,上海 201203)
苦参碱(matrine,MT)和氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)是中药苦参和山豆根主要成分和质量标准[1]。苦参碱和氧化苦参碱具有抗肿瘤、抗炎、抗乙肝病毒和抗肝纤维化作用以及镇痛和镇静作用[2-6],氧化苦参碱还表现出对心肌的保护作用[7-8],临床用于治疗癌症、慢性肝炎、肝纤维化和心肌病。苦参碱和氧化苦参碱药效比较已有报道[9-10],苦参碱的镇痛作用优于氧化苦参碱;苦参碱的抗炎作用小于氧化苦参碱。然而,关注苦参碱和氧化苦参碱毒性的研究很少,只有少数报道表明苦参碱和氧化苦参碱具有毒性[11-12],但其毒性的比较、毒性特征和机制仍不清楚。
本研究首次使用体内斑马鱼模型比较苦参碱和氧化苦参碱的肝脏毒性,并通过体外肝细胞模型进行验证。本研究的目的是探索这些化合物的肝毒性严重程度、特征和初步毒性机制,为临床使用和安全使用含苦参碱和氧化苦参碱的中药提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验细胞与实验动物
L-02肝细胞:香港大学馈赠;AB-line斑马鱼:南方医科大学提供。
1.2 主要试剂与仪器
苦参碱(纯度99.1%,批号130622)和氧化苦参碱(纯度99.3%,批号130610),上海荣和制药有限公司提供;对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP),广州白云山药业有限公司提供;MTT:美国Amersco;丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)试剂盒:南京建成生物工程公司;威廉姆斯培养基(WME):美国Sigma。
酶标仪(ELX800,Biotek,美国),生化分析仪(7100,Hitachi,日本),荧光显微镜(BX51,Olympus,日本),ABI7900HT序列检测系统(AB公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 体外肝细胞模型毒性比较研究
(1)细胞培养与处理:将肝细胞以每平方厘米1 × 105个细胞接种在24孔板上进行培养。培养液为威廉姆斯培养基,含10%胎牛血清(FBS),10 U/L胰岛素铁硒传递蛋白(ITS),10 U/L地塞米松,4 × 107U/L青霉素和100 mg/L链霉素,5% CO2培养箱37℃培养48 h。IC50检测中,48 h后除对照孔外,加入对乙酰氨基酚32 mmol/L,苦参碱1、3、8、20 mmol/L,氧化苦参碱3、8、19 mmol/L,设5个复孔。其余试验中,加入对乙酰氨基酚32 mmol/L,苦参碱3、8、20 mmol/L,氧化苦参碱3、8、19 mmol/L,设5个复孔。
(2)IC50检测:24 h后,加入100 μL MTT孵育4 h后加入150 μL二甲基亚砜(DMSO),振荡孵育10 min,630 nm和490 nm检测吸光度。计算抑制百分比:(D490-D630)/(D490-D630) × 100%,并计算IC50值。
(3)肝细胞酶检测:24 h后,收集培养基,检测谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT),谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)。
(4)肝细胞形态学检查:采用细胞爬片技术制片。HE染色检查肝细胞形态。肝细胞病理分级如下:①正常肝细胞具有完整的结构:“-”,0级;②肝细胞轻度肿胀:“+”,1级;③肝细胞中度肿胀:“++”,2级;④肝细胞严重肿胀和破裂:“+++”,3级;⑤肝细胞坏死:“++++”,4级。
(5)丙二醛和谷胱甘肽含量测定:24 h后,用1.8 g/L胰蛋白酶消化,收集细胞并悬浮于低渗Tris缓冲液中,4000 r/min离心10 min。收集上清液,检测丙二醛和谷胱甘肽含量。
(6)肝细胞凋亡检测:细胞爬片后,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤5 min,然后用DAPI染色20 min,检测细胞凋亡。每个样本随机选5个区域计数凋亡细胞数,计算凋亡百分比:凋亡细胞数/细胞数× 100%。
1.3.2 体内斑马鱼模型毒性比较研究
(1)斑马鱼饲养与处理:水温为(23±1) ℃,pH为(7.8±1),硬度250 mg/L,光照时间为12 h。实验方案符合广州医药研究总院有限公司动物福利与伦理委员会(EX-EL2012005-01)的要求。LC50试验中,对乙酰氨基酚8 mmol/L,苦参碱0.26、0.32、0.40、0.50、0.63 mmol/L,氧化苦参碱3.8 mmol/L;其余试验中,对乙酰氨基酚8 mmol/L,苦参碱0.26、0.40、0.63 mmol/L,氧化苦参碱3.8 mmol/L。
(2)LC50检测:药物处理后观察动物的日常外观、行为和采食情况。96 h后,快速冷冻将动物进行安乐死,计算LC50值。
(3)肝细胞形态学检查:96 h后动物安乐死。取肝脏,石蜡切片,HE染色。检查肝细胞形态。肝细胞病理分级如下:①正常肝细胞具有完整的结构:“-”,0级;②肝细胞轻度空泡化:“+”,1级;③肝细胞中度空泡化:“++”,2级;④肝细胞严重空泡化:“+++”,3级;⑤肝细胞坏死:“++++”,4级。
(4)丙二醛和谷胱甘肽含量测定:取斑马鱼肝脏匀浆,3000 r/min离心10 min。收集上清液检测丙二醛和谷胱甘肽含量。
(5)肝细胞凋亡检测:取肝脏石蜡切片,将切片脱蜡后,PBS中洗涤5 min,DAPI染色20 min,检测肝细胞凋亡。检测方法同体外肝细胞。
(6)氧化应激和凋亡相关基因检测:取对照组和苦参碱(0.40 mmol/L)组斑马鱼肝脏。检测基因zgc: 136383,zgc: 123120和EIF4EBP3的表达。PCR条件如下:95℃,5 min;95℃,10 s;60℃,30 s;使用2× QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix进行40个循环。引物设计如下(5’→3’):GAPDH-F:GTGACCCCTTTGCTGTTTCTTT,GAPDH-R:GGCAC GTGGTGCAAACATT;zgc136383-F:GTTCCCATCAA TCCAGACGGT,zgc136383-R:TGACAGTTCTGCATC AACACATC;EIF4EBP3-F:AAGAAAGCACATCAGAA CATAAA,EIF4EBP3-R:GAAATCCAGGCAAACGAA A;zgc123120-F:CCAGACACCTCCCCTCATT,zgc123120-R:CTCTCCAGCACAACTTCCC。
1.4 统计学方法
2 结果
2.1 体外肝细胞模型毒性比较研究
2.1.1 IC50检测
结果显示,对乙酰氨基酚(32 mmol/L)对肝细胞具有明显的抑制作用,苦参碱和氧化苦参碱也具有明显的抑制作用;苦参碱和氧化苦参碱的IC50值分别为5.3 mmol/L和> 19 mmol/L。因此,苦参碱对肝细胞的抑制作用明显大于氧化苦参碱。
2.1.2 肝细胞酶检测
结果显示(表1),对乙酰氨基酚(32 mmol/L)组细胞的ALT、AST、ALP和LDH含量增加(P< 0.01);苦参碱(20 mmol/L)组细胞ALT、AST、ALP和LDH含量均升高(P< 0.01),而苦参碱(8 mmol/L)组细胞仅ALP、LDH含量增加(P< 0.01);氧化苦参碱(19 mmol/L)组细胞的AST、ALP和LDH含量增加(P< 0.01)。与氧化苦参碱(19 mmol/L)相比,苦参碱(20 mmol/L)组细胞ALT、AST、ALP和LDH含量升高(P< 0.05或P< 0.01)。
表1 苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞酶的影响
注:与对照组相比,*P< 0.05,**P< 0.01;与氧化苦参碱组相比,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the OMT group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.
2.1.3 肝细胞形态学检查
结果显示(图1),对乙酰氨基酚(32 mmol/L)组肝细胞数减少,肝细胞出现严重肿胀,有些细胞核消失(P< 0.05);苦参碱(20 mmol/L)组肝细胞数减少,肝细胞呈轻度至中度肿胀(P< 0.05);苦参碱(8 mmol/L)和氧化苦参碱(19 mmol/L)组的肝细胞轻度肿胀(P> 0.05)。与氧化苦参碱(19 mmol/L)相比,苦参碱(20 mmol/L)组肝细胞形态变化更严重(P< 0.05)。
注:A:对照组(-);B:对乙酰氨基酚组(32 mmol/L)(+++);C:苦参碱组(20 mmol/L)(-);D:苦参碱组(8 mmol/L)(+++);E:苦参碱组(3 mmol/L)(+);F:氧化苦参碱组(19 mmol/L)(+);G:氧化苦参碱组(8 mmol/L)(-);H:氧化苦参碱组(3 mmol/L)(-)。图1 苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞形态的影响(HE染色,× 400)Note. A: Control group (-); B: APAP group (32 mmol/L) (+++); C: MT group (20 mmol/L) (-); D: MT group (8 mmol/L) (+++); E: MT group (3 mmol/L) (+); F: OMT group (19 mmol/L) (+); G: OMT group (8 mmol/L) (-); H: OMT group (3 mmol/L) (-).Fig.1 Effects of matrine and oxymatrine on morphology of the cultured liver cells. HE staining
2.1.4 肝细胞丙二醛和谷胱甘肽含量测定
结果显示,对乙酰氨基酚(32 mmol/L)组肝细胞丙二醛含量增加,谷胱甘肽含量降低(P< 0.05);苦参碱(20 mmol/L)组肝细胞丙二醛含量增加(P< 0.05),谷胱甘肽含量降低(P< 0.01);苦参碱(8 mmol/L)(P< 0.05)和氧化苦参碱(19 mmol/L)(P< 0.01)组肝细胞谷胱甘肽含量也降低。与氧化苦参碱(19 mmol/L)相比,苦参碱(20 mmol/L)组肝细胞的谷胱甘肽含量显著降低(P< 0.01)。
2.1.5 肝细胞凋亡检测
结果显示(图2),对乙酰氨基酚(32 mmol/L)组肝细胞核的荧光密度增加,肝细胞凋亡百分比显著增加(P< 0.05);苦参碱(20、8 mmol/L)和氧化苦参碱(19 mmol/L)组部分肝细胞凋亡,凋亡百分比增加(P< 0.05)。与氧化苦参碱(19 mmol/L)相比,苦参碱(20 mmol/L)组肝细胞凋亡率明显升高(P< 0.05)。
注:A:对照组(-);B:对乙酰氨基酚组(32 mmol/L)(+++);C:苦参碱组(20 mmol/L)(-);D:苦参碱组(8 mmol/L)(+++);E:苦参碱组(3 mmol/L)(+);F:氧化苦参碱组(19 mmol/L)(+);G:氧化苦参碱组(8 mmol/L)(-);H:氧化苦参碱组(3 mmol/L)(-)。图2 苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞凋亡的影响(DAPI染色,× 400)Note. A: Control group (-); B: APAP group (32 mmol/L) (+++); C: MT group (20 mmol/L) (-); D: MT group (8 mmol/L) (+++); E: MT group (3 mmol/L) (+); F: OMT group (19 mmol/L) (+); G: OMT group (8 mmol/L) (-); H: OMT group (3 mmol/L) (-).Fig.2 Effects of matrine and oxymatrine on apoptosis in the cultured liver cells. DAPI staining
2.2 体内斑马鱼模型的毒性比较研究
2.2.1 LC50检测
结果显示,对乙酰氨基酚(8 mmol/L)对斑马鱼具有明显的毒性。苦参碱(0.26~0.63 mmol/L)处理3 h后,斑马鱼出现游泳失衡和活动减少;浓度> 0.32 mmol/L引起死亡,LC50为0.41 mmol/L。氧化苦参碱(3.8 mmol/L)处理斑马鱼6 h后,斑马鱼出现游泳失衡和活动减少,但大多数在24 h后恢复;氧化苦参碱的LC50为> 3.8 mmol/L。
2.2.2 肝细胞形态学检查
结果显示(图3),对乙酰氨基酚(8 mmol/L)引起斑马鱼肝细胞轻度至严重空泡化(P< 0.05);苦参碱(0.63 mmol/L)引起斑马鱼肝细胞轻度至严重空泡化(P< 0.05)。与氧化苦参碱(3.8 mmol/L)组相比,苦参碱(0.63 mmol/L)组肝细胞形态学变化更为严重(P< 0.05)。
注:A:对照组;B:对乙酰氨基酚组(8 mmol/L)(+++);C:氧化苦参碱组(3.8 mmol/L)(+);D:苦参碱组(0.63 mmol/L)(++);E:苦参碱组(0.40 mmol/L)(+);F:苦参碱组(0.26 mmol/L)(-)。图3 苦参碱和氧化苦参碱对斑马鱼肝细胞形态的影响(HE染色,× 400)Note. A: Control group (-); B: APAP group (8 mmol/L) (+++); C: OMT group (3.8 mmol/L) (+); D: MT group (0.63 mmol/L) (++); E: MT group (0.40 mmol/L) (+); F: MT group (0.26 mmol/L) (-).Fig.3 Effects of matrine and oxymatrine on morphology of the liver cells in zebrafish. HE staining
注:A:对照组;B:对乙酰氨基酚组(8 mmol/L);C:氧化苦参碱组(3.8 mmol/L);D:苦参碱组(0.63 mmol/L);E:苦参碱组(0.40 mmol/L);F:苦参碱组(0.26 mmol/L)。图4 苦参碱和氧化苦参碱对斑马鱼肝细胞凋亡的影响(DAPI染色,× 400)Note. A: Control group; B: APAP group (8 mmol/L); C: OMT group (3.8 mmol/L); D: MT group (0.63 mmol/L); E: MT group (0.40 mmol/L); F: MT group (0.26 mmol/L).Fig.4 Effects of matrine and oxymatrine on apoptosis in the liver cells of zebrafish. DAPI staining
2.2.3 丙二醛和谷胱甘肽含量测定
结果显示,对乙酰氨基酚(8 mmol/L)组肝细胞丙二醛含量明显升高(P< 0.05);苦参碱(0.63、0.40 mmol/L)组的丙二醛含量增加,而谷胱甘肽含量降低(P< 0.01或P< 0.05)。与氧化苦参碱(3.8 mmol/L)相比,苦参碱(0.63 mmol/L)组肝细胞丙二醛含量明显升高(P< 0.01),谷胱甘肽含量明显降低(P< 0.05)。
2.2.4 肝细胞凋亡检测
表2 苦参碱对斑马鱼氧化应激和凋亡基因表达的影响
注:以对照组表达水平为1,分别对苦参碱组各目标基因的表达倍数进行校正。具体计算公式为:表达差(△△Ct)=苦参碱组Ct差-对照组Ct差,其中,Ct差(△Ct)=目标基因Ct值-内参(GAPDH)Ct值,Ct值为实验测得qPCR的循环数;表达倍数=2-△△Ct。与对照组相比,*P< 0.05。
Note. The expression level of each target gene in the control group was set as 1, and the expression fold in the MT group was normalized respectively. The specific formulas are as follows:△△Ct=△Ct of the MT group-△Ct of the control group;△Ct=Ct value of the target gene - Ct value ofGAPDH(as the internal control); Ct value refers to the qPCR cycles detected in this experiment. Relative folds to the control group=2-△△Ct. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.
结果显示(图4),对乙酰氨基酚(8 mmol/L)组斑马鱼肝细胞凋亡率明显升高(P< 0.05);苦参碱(0.63、0.40 mmol/L)组斑马鱼肝细胞凋亡率升高(P< 0.01)。与氧化苦参碱(3.8 mmol/L)组相比,苦参碱(0.63、0.40 mmol/L)组斑马鱼肝细胞凋亡率明显升高(P< 0.05)。
2.2.5 氧化应激和凋亡相关基因检测
结果显示(表2),苦参碱(0.40 mmol/L)组基因zgc: 136383下调至0.001(P< 0.05),表明苦参碱诱导的氧化应激与zgc: 136383的下调相关。基因zgc: 123120上调至1.22(P< 0.05),EIF4EBP3基因下调至0.02(P< 0.05),说明苦参碱诱导的细胞凋亡与EIF4EBP3的下调和zgc: 123120的上调有关。
3 讨论
本实验采用人肝细胞作为体外模型保留人类的特征,保持肝细胞的生理和代谢特征,可以直接反映药物的肝毒性。IC50值是衡量肝毒性的重要参数。与体外模型相比,斑马鱼模型可更准确地预测药物毒性;此外,与哺乳动物模型相比,斑马鱼模型测试周期短,成本低和用药量少,更符合动物福利伦理。因此,斑马鱼模型对于预测肝脏毒性是准确可靠的[13-14]。LC50是衡量化学物质在水中的毒性的重要参数。本研究预测试结果显示,氧化苦参碱(3.8 mmol/L)处理并未引起斑马鱼死亡。根据ISO734561-3“物质对淡水鱼的急性毒性的水质测定”,氧化苦参碱的毒性非常小;因此,正式试验中氧化苦参碱的浓度为3.8 mmol/L。
本研究中,阳性对照药对乙酰氨基酚对肝细胞和斑马鱼具有明显的毒性作用。体外模型结果与体内模型结果一致,表明本研究使用的系统稳定可靠,可用于药物评价。
本研究中,体外肝细胞模型表明苦参碱的毒性明显大于氧化苦参碱。苦参碱和氧化苦参碱导致斑马鱼游泳不平衡,这可能与神经毒性有关[15],苦参碱对斑马鱼的毒性明显大于氧化苦参碱。体内外模型结果一致。
苦参碱(C15H24N2O)与氧化苦参碱(C15H24N2O2)结构相似。苦参碱是氧化苦参碱体内的代谢产物之一。苦参碱注射后转化率约为30%,氧化苦参碱仅为6%[16]。苦参碱在肝脏中的分布明显高于氧化苦参碱[17]。这可能是苦参碱毒性明显大于氧化苦参碱的原因。
本研究进一步探讨了苦参碱和氧化苦参碱的初步肝毒性机制。大量研究表明肝毒性的主要机制是氧化应激和细胞凋亡[18-20]。因此,本研究中检测到氧化应激和凋亡相关指标。丙二醛含量可反映身体脂质过氧化程度,间接反映细胞损伤程度[21-22]。谷胱甘肽含量映身体抗氧化能力的重要因素[23]。本研究表明其肝脏毒性机制与氧化应激相关。基因zgc: 136383的功能是参与脂质转运调控,苦参碱使该基因表达下调,使脂质转运功能受损,增加了细胞脂质积累,激活了氧化应激。
凋亡是一种细胞死亡形式[24]。DAPI可以通过细胞膜,与双链DNA结合标记细胞核。凋亡发生时,染色质收缩聚集或进一步收缩形成颗粒,或细胞核分解形成碎片[25]。本研究表明肝毒性机制与细胞凋亡相关。基因zgc: 123120编码一种Bcl-2家族/腺病毒相互作用蛋白,其与促凋亡基因结合以促进凋亡。基因EIF4EBP3编码的蛋白是EIF4EBP家族的成员,作为蛋白激酶B的mTOR,激活蛋白激酶B并对线粒体凋亡途径具有抗凋亡作用。苦参碱使基因EIF4EBP3表达下调,zgc: 123120表达上调,抗凋亡能力减弱,促凋亡能力增强,使肝细胞发生凋亡。
苦参碱是中药山豆根和苦参的药效和毒性物质基础。本研究表明高剂量的苦参碱对肝脏有毒性,临床使用大剂量的中药苦参和山豆根时应考虑药物的安全性。
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