大鼠门静脉高压对血清内毒素及肠黏膜的影响分析

李晓娟，张巧云，冯 帆，姜棋予，柴燕涛，李 润，侯 俊*，李瑞生*

(1.解放军第302医院临床研究管理中心，北京 100039； 2.山东省蓬莱市中医医院检验科，山东 蓬莱 265600)

门脉高压和内毒素血症是肝硬化晚期最常见的并发症[1]。内毒素(endotoxin，ET)是革兰氏阴性菌细胞壁上的脂多糖，可通过多种途径介导机体损伤[2]。当肝硬化形成时，肝内组织结构发生改变导致肝脏枯否细胞对内毒素的清除下降。同时门脉高压形成后致侧枝循环开放，也使内毒素在肝内的清除下降，上述这两种原因均导致内毒素可以绕过肝脏直接进入体循环[3]。目前研究表明肠道除了具有消化吸收功能之外，还具有内分泌、免疫和屏障功能，而肝功能正常与否与肠源性内毒素血症的发生密切相关[4]，尤其肝肠相互作用轴已成为目前研究的热点，假设肠粘膜屏障功能障碍，会加重肠道微生态平衡的破坏及机体免疫功能的损害[5-6]。因此本实验利用SD大鼠构建肝脏功能正常基础上的单纯性门脉高压模型，分别取不同时间点检测血清内毒素的变化以及肠道病理的变化，旨在分析在单纯性门脉高压的情况下，内毒素和肠道通透性的变化情况，以期为肝硬化肠肝互作的研究提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

动物选择军事医学科学院实验动物中心SPF级SD大鼠16只，雄性，单鼠体质量190～200 g [SCXK (军) 2012-004]。饲养室温度22℃～23℃，环境湿度50%，自由进食和饮水 [SYXK (军) 2012-010]。

1.2 主要试剂与仪器

大鼠内毒素ELISA试剂盒(科晶生物，KJ-1908)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，20151023)。显微外科手术器械；K10CD型干浴恒温箱(杭州奥盛仪器有限公司)；TD型电子天平(余姚市金诺天平有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制备

实验分别取4只大鼠作为空白对照组，12只大鼠作为门脉部分结扎模型组。模型构建：在无菌条件下，使用水合氯醛(浓度为10%)进行麻醉，注射剂量为每只0.7 mL，待大鼠进入深麻醉状态，作剑突下正中切口2.0～3.0 cm，将肝脏轻轻向上翻起，将胃肠轻轻向右拨开，放置于生理盐水浸润的纱布上可以清晰的看到门静脉的位置。钝性分离门静脉，在门静脉外缘平行放置2根外径为0.8 mm的平头空心管，用4/0丝线结扎门静脉主干和与之并行的钝性针头，结扎完后，轻轻拔出平头空心管，关腹。对照组作假手术仅游离门静脉，脏器复位后分层关腹。实验过程中均遵循3R原则，对动物实施人道主义关怀。

1.3.2 内毒素测定

首先通过大鼠眶后静脉丛采集空白对照组大鼠血液，随后分别在3 d、7 d、10 d采集模型组大鼠血液，室温静置30 min，离心取血清，用ELISA法检测血清中内毒素的结果，每个样本均进行3个复孔检测。所有实验器材均采用去热原处理。

1.3.3 肠道病理检查

空白对照组在首次采集完血液后，模型组分别在3 d、7 d、10 d采集血液后，处死大鼠，分别采集空肠、回肠、结肠。用4%甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋、切片和HE染色，光学显微镜下行病理组织形态学观察[7]，根据病理切片结果对不同部位肠黏膜的变化过程进行分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠门脉部分结扎模型构建及一般状态

12只模型组大鼠均成功分离出门静脉，并进行门静脉部分结扎手术(见图1)。术后大鼠一般状况均良好，饮食正常，随着时间的推移也未出现各种不适以及精神萎靡的状况。

2.2 不同时间点大鼠内毒素的变化

空白对照组和模型组(3 d、7 d、10 d)每只大鼠的样本均进行3孔重复，得出每个样本的内毒素均数。然后各组相互之间进行统计学分析，结果显示，各模型组血清内毒素的结果与正常对照组之间差异无显著性(见表1)。

注：A：麻醉剖腹探查门静脉；B：钝性分离门静脉；C：部分结扎门静脉。图1 大鼠门脉部分结扎模型Note. A: Exploration of the portal vein by laparotomy after anesthesia. B: Blunt separation of the portal vein. C: Partial ligation of the portal vein.Fig.1 Partial portal vein ligation in a rat

组别Groups正常组Normalgroup模型组(3d)Modelgroup(3d)模型组(7d)Modelgroup(7d)模型组(10d)Modelgroup(10d)内毒素含量Endotoxinlevels5114±2624319±8054364±5294160±764

注：箭头所指为黏膜脱落部位。图2 大鼠不同时间点空、回、结肠病理学结果(HE染色，× 10)Note. Arrows indicate the abscission sites of epithelial cells in the intestinal mucosa.Fig.2 Histopathological changes of the jejunum, ileum and colon at different time points in the rats of different groups. HE staining

2.3 不同时间点大鼠肠道病理组织学结果

病理组织学观察结果表明：空白对照组大鼠空肠、回肠和结肠的病理组织结构整齐，粘膜分层规则清晰，各层结构完整，上皮细胞与固有层间连结紧密无缝隙；成模3 d后各肠段的粘膜层次依然较整齐清晰，上皮与固有层的连接还未出现缝隙；而成模7 d后各肠段较3 d粘膜层的局部肠绒毛出现了部分破坏和肿胀，上皮细胞与固有层间连结出现了松散的状况；成模10 d较3 d和7 d的肠黏膜发生了较大的损伤：肠绒毛排列凌乱，部分肿胀溶解，粘膜上皮细胞可见萎缩脱落。黏膜下炎症细胞浸润增多，上皮细胞与固有层的间距可见明显增宽；而固有层腺体明显减少及破坏。

3 讨论

在正常情况下，肠黏膜屏障在保持机体内环境稳定方面发挥了重要作用，肠黏膜能够阻止肠道细菌、内毒素向肠外移位，保护机体免受食物抗原、微生物及其有害代谢产物的损害[8]。而当肝硬化尤其是出现门脉高压合并腹水时，肠黏膜屏障系统也会随之发生功能改变。徐义军等[9]发现当肠道通透性显著增加后，早期即可出现细菌移位并形成内毒素血症。施琳琳等[10]也验证了应用中药大黄可以改善由于肝硬化导致内毒素灭活减少，肠免疫功能紊乱而导致的肠道菌群异常增生和肠源性内毒素吸收增加形成的肠源性内毒素血症。而在肝功能正常状态下形成门脉高压以观察内毒素和肠黏膜改变的研究尚未报道。

因此本实验应用SD大鼠构建肝脏功能正常的单纯性门脉高压模型，分别取不同时间点检测血清内毒素的变化情况以及胃肠道病理变化情况，结果显示，模型组大鼠均成功构建了门脉部分结扎模型。术后大鼠一般状况均良好，饮食正常，随着时间的推移也未出现各种不适以及精神萎靡的状况。此法与王继见等[11]使用Wistar大鼠构建门脉部分结扎模型相似，此法操作简便、快速，成模时间短，且能对门静脉部分结扎后到形成门脉高压期间检测的各项指标进行动态观察。本实验对不同时间点的血清内毒素进行检测结果显示，不同时间点内毒素差异无显著性。经过分析发现，肝脏作为体内清除内毒素和解毒的主要脏器，是遭受内毒素攻击的首要器官。而在正常情况下，肝脏具有很强的内毒素灭活能力，由此看出，肝脏正常时可以将来自门静脉的内毒素完全灭活，因而不会发生内毒素血症。若肝脏受损如肝硬化时，对内毒素的灭活能力下降，则容易发生肠源性内毒素血症[12]。因此推断在本实验的操作过程中，由于肝脏功能未受损，内毒素的升高还未超出肝脏处理内毒素的上限，因此内毒素未出现很大的波动。但是不同部位肠段的病理结果显示，成模3 d后各肠段也未发生很大的损伤，成模7 d后各肠段局部肠绒毛出现了部分破坏和肿胀，上皮细胞与固有层间连结出现了松散的状况；成模10 d较3 d和7 d肠段均出现了明显的损伤。肠粘膜屏障是由机械屏障、化学屏障、生物屏障以及免疫屏障共同构成。在肠粘膜机械屏障组成成分中，肠上皮细胞及其紧密连接是最重要的组成部分[13-14]。因此本实验单纯门脉高压可以造成肠黏膜出现损伤，如果继续发展将会使进入门静脉的内毒素不断增加，最终如果超出了肝脏的清理能力，就可能会逆流入血形成内毒素血症，这一点有待进一步实验验证。

综上所述，本实验通过单纯制造门脉高压模型检测内毒素和肠黏膜变化情况发现，在短时间内，在肝功能正常的情况下，门脉高压可以造成肠黏膜的损伤，而肠道产生的内毒素不会很快超出肝脏的处理能力而出现血清内毒素升高的现象，为今后研究肝硬化门脉高压与内毒素血症和肠黏膜损伤的发病机制提供一定的理论依据。

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