TLR9激动剂对约氏疟原虫记忆性T细胞的影响

刘文婷， 张 宁

(中国医科大学附属盛京医院 第二风湿免疫科，辽宁 沈阳 110004)

疟疾是当今对人类危害最为严重的三大感染性疾病之一，WHO最新报告显示，疟疾的感染率和发病率仍然居高不下，再感染或重复感染在流行区屡见不鲜[1]。除与抗原变异相关外，机体未能产生持久的免疫记忆或许是导致这一现象发生最主要因素[2]。因此，探明影响疟疾免疫记忆建立与维持的相关因素则具有极为重要的现实意义。树突状细胞(Dendritic Cell, DC)是唯一能够活化初始 T 细胞的专职抗原递呈细胞，也是连接固有和适应性免疫应答的桥梁细胞。Toll样受体 (Toll like receptor，TLR)是DC识别疟原虫抗原的主要模式识别受体，其表达水平和强度可直接介导DC对效应性细胞活化的调控[3]，进而影响免疫记忆的建立与维持[4]。尽管有资料显示，记忆性T细胞在抵御再感染过程中发挥举足轻重的作用[5-6]，但有关TLR9激动剂是否能直接促进疟疾记忆性T细胞的产生和持续存在却少有报道。鼠疟模型因重复性好、可操作性强已成为抗疟免疫发生机制研究的首选模型。我国流行的主要疟疾虫种是间日疟，其生物学特征与非致死型约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii17XNL，P.y17XNL)具有一定相似性[7]。为此，利用TLR9激动剂处理的P.y17XNL 鼠疟模型，通过分析再感染状况与再感染前后脾细胞中记忆性和活化性CD4+T细胞的百分率及其相关效应分子分泌水平之间的关系，进一步明确TLR9激动剂对疟疾记忆性T细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠和疟原虫 BALB/c小鼠，雌性，1.5～2月龄(中科院实验动物研究所)，腹腔感染P.y17XNL寄生的红细胞(1×106个)；感染前2 d，小鼠经胫骨前肌肉分别注射CpGl826和CpGl982(对照)，50 μg/只。90 d后，用1×106个P.y17XNL寄生的红细胞对小鼠进行第二次感染。

1.1.2 脾细胞采集与培养 无菌条件下处死正常、CpGl826注射及其对照组小鼠，摘取脾脏， 200目筛网上研磨，用含5%(体积分数)FCS的RPMI 1640细胞培养液制成悬液，350 g离心10 min，红细胞裂解液去除红细胞，10%(体积分数)FCS的RPMI 1640悬浮细胞，调整浓度为1×107/mL，待后续染色与检测。用24孔培养板对部分脾细胞进行培养，每孔加脾细胞悬液500 μL，37 ℃温箱培养48 h，-80 ℃保存收集的培养上清，待IFN-γ和IL-10检测。

1.1.3 主要试剂与仪器 CpGl826、T细胞的各种标记抗体和细胞因子检测试剂盒分别购自Takara公司、BD Pharmingen公司和R&D Systems公司，酶标检测仪和流式细胞仪分别购自InterMed公司和BD公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠感染状态观察 感染不同时间点的小鼠经尾尖取血，涂薄血膜，吉姆萨染色10 min，显微镜下观察红细胞感染状态。

1.2.2 细胞因子检测 按说明书操作程序，用细胞因子检测试剂盒检测脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-10水平。酶标仪检测450 nm处OD值，以标准品绘制标准曲线，应用SoftMaxPro 4.3.1Ls软件分析计算细胞因子含量(pg/mL)。

1.2.3 记忆性和活化性T细胞检测 在0.1 mL待测脾细胞悬液中加入FITC-conjugated anti-mouse CD4 mAb、APC-conjugated anti-mouse CD62L mAb和PE-conjugated anti-mouse CD45RO mAb用以记忆性T细胞检测；而加入FITC-conjugated anti-mouse CD4 mAb和PE-conjugated anti-mouse CD69 mAb用以活化性T细胞检测。4 ℃避光染色30 min，以含1% (体积分数)FCS的PBS洗涤2次，用500 μL含2%(体积分数)多聚甲醛的PBS固定悬浮，流式细胞分析仪检测，利用FlowJo7.6.3软件对数据进行分析。

1.2.4 数据统计与分析 数据经t- test，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 TLR9激动剂对虫血症水平的影响

初次感染后3 d可见疟原虫感染的红细胞，随后感染率逐渐增加，感染后13 d TLR9激动剂处理组和对照组的感染率达到峰值，分别为10.82%和12.25%，但前者感染15 d后下降较快，90%小鼠于感染后19 d自愈(图1A)；二次感染后，TLR9激动剂处理组和对照组的10只鼠中分别有5只(50%)和7只(70%)出现疟原虫感染的红细胞，其峰值感染率分别为0.64%和0.82%(图1B)。这表明，TLR9激动剂对控制初次感染后期虫血症水平以及降低再感染发生率和红细胞感染率均具有一定作用。

图1 初次感染红细胞感染率(A)和二次感染红细胞感染率(B)Fig.1 The erythrocyte infection rate at different time points after primary infection(A) and reinfection(B) with P.y17XNL

2.2 TLR9激动剂对活化性T细胞的影响

细胞免疫是抵御再感染重要因素之一。图2显示，二次感染前，TLR9激动剂处理组与对照组小鼠脾CD4+T细胞中活化性CD4+T细胞百分率分别为2.88%和3.02%，感染后1 d，两组均出现了明显升高(*P<0.01)，分别达到6.62%和5.04%，但前者升高幅度比对照组更为显著(#P<0.05)，感染后3 d也显示同样趋势。这表明TLR9激动剂对再感染的细胞免疫应答具有一定促进作用。

图2 P.y17XNL再感染0 、1 和3 d活化性CD4+T细胞百分率Fig.2 The percentage of actived T cells on day of 0, 1 and 3 after reinfection with P.y17XNL *: 与二次感染前同组小鼠相比P<0.01；#: 与对照组小鼠相比P<0.05*: P<0.01 when compared with pre-reinfection mice in the same group；#: P<0.05 when compared with control mice

2.3 TLR9激动剂对记忆性T细胞的影响

再感染后活化性T细胞百分率迅速升高可能与其体内存在的记忆性T细胞数量具有一定相关性。图3显示，再感染前TLR9激动剂处理组及对照组的记忆性CD4+T细胞百分率分别为12.98%和10.16%，再感染后3 d分别达到16.52%和14.44%，均出现了明显升高(*P<0.05)。在每一检测时点TLR9激动剂处理鼠的水平均高于对照组。这表明，TLR9激动剂对初始感染细胞免疫记忆的维持和再感染免疫记忆的提高均有一定促进效应。

图3 P.y17XNL再感染0、1 和3 d记忆性CD4+T细胞百分率Fig.3 The percentage of memory T cells on day of 0, 1 and 3 after reinfection with P.y17XNL

2.4 TLR9激动剂对细胞因子分泌水平的影响

细胞因子分泌水平是反映T细胞活化程度的主要标志。图4显示，再感染前脾细胞培养上清中TLR9激动剂处理组及对照组的IFN-γ水平分别为106.3 pg/mL和83.46 pg/mL，IL-10分别为88.08 pg/mL和77.16 pg/mL；再感染后1 d两组的 IFN-γ水平均明显升高(*P<0.01)，分别达到372.74 pg/mL和216.17 pg/mL；再感染后3 d 的IL-10分别达到479.84 pg/mL和394.26 pg/mL，也均出现了显著升高(*P<0.01)。尽管没有组间差异，TLR9激动剂处理组每一检测点IFN-γ水平和再感染后第3天的IL-10水平均高于对照组。这表明TLR9激动剂可使再感染小鼠首先快速建立Th1反应，而后又产生了一定水平的Th2反应。

图4 P.y17XNL再感染不同时点IFN-γ和IL-10水平Fig.4 The levels of IFN-γ and IL-10 at different time points after reinfection with P.y17XNL

3 讨 论

有文献报道，在抵御灵长类疟原虫再感染过程中，CD4+T细胞介导的细胞免疫是不可或缺的因素[6]；流行病学调查也显示，恶性疟原虫感染者，若能产生高水平IFN-γ，既可降低再感染的发生率，又可明显延迟再感染的发生时间[8]；间日疟原虫感染可促进记忆性CD4+T细胞产生，并以此抵御再感染的发生[5]。由此表明，机体抵御疟疾再感染的发生主要依赖于持久性免疫记忆的存在。

DC对T细胞的应答强度以及促炎性和抗炎性细胞因子分泌水平的调控直接影响免疫记忆的建立和维持[3-4]，而DC实现对T细胞的激活效应主要取决于TLR的存在，作为多受体家族的一员，TLR9主要识别疟原虫的DNA和疟色素[9]。在TLR9介导下，DC完成对疟原虫抗原的内化，上调多种表面分子表达，进而调控CD4+T细胞的分化。实验表明，TLR9缺陷鼠不能建立有效的Th1应答[10]；TLR9激动剂可上调促炎性细胞因子和下调抗炎性细胞因子分泌[11]，而记忆性T细胞的产生又明显取决于初始应答强度[12]。这些结果提示，干预TLR9表达水平及活性或许可直接影响记忆性T细胞的产生。

研究显示，外源性TLR9激动剂不仅对控制初次感染后期虫体血症水平具有一定作用，同时可维持一定数量记忆性CD4+T细胞的持续存在；二次感染后，活化性CD4+T细胞数量迅速升高并分泌高水平Th1型细胞因子IFN-γ，进而有效降低再感染发生率和虫血症水平；活化性T细胞短时间内迅速增加除与一些初始T细胞活化有关外，更可能是其体内存在的记忆性T细胞的迅速活化所致。有研究证明，疟疾的长期免疫保护主要依赖记忆性T细胞的持续存在，保护效应强弱与记忆性T细胞的数量及功能密切相关，少许数量记忆性T细胞的存在也可明显降低再感染的发生率[13]。这与我们的结果基本吻合。此外，我们的研究还显示，当IFN-γ达到峰值水平后，IL-10也出现有意义的升高，表明TLR9激动剂可使宿主获得更为协调的免疫调节功能。本研究从固有免疫应答入手，证明了TLR9激动剂对鼠疟记忆T细胞的产生和维持有一定促进作用，这或许为疟疾免疫干预策略的确立和疫苗方案的设计提供了一些新依据。

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