响应面法优化杜仲叶中绿原酸提取工艺

2018-01-30邓爱华李红勇彭才旺程丽楠

经济林研究 2018年1期

邓爱华，李红勇，谢鹏，王云，彭才旺，程丽楠

（1.湖南文理学院生命与环境科学学院，湖南常德 415000；2.湖南人文科技学院农业与生物技术学院，湖南娄底 417000）

杜仲Eucommia ulmoides Oliv为杜仲科落叶乔木，是我国特有经济植物，主要分布于湘、桂、川、滇及长江中下游流域等[1-2]。据《本草纲目》记载，杜仲皮为名贵滋补药材，而杜仲树剥皮后容易死亡，制约了杜仲的药用价值推广[3]。现代研究发现，杜仲叶与杜仲皮具有相同的功能成分和药理功效，杜仲叶中活性成分绿原酸含量高达5%，且富含京尼平苷、桃叶珊瑚苷等[4-5]。绿原酸具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、保护心血管和清除体内自由基等作用[6-7]，对治疗血液、消化及生殖系统等方面的疾病有显著效果[8]。因此，杜仲中绿原酸的提取开发成为研究者关注的热点[9-11]。

绿原酸属于极性有机酸，一般采用极性较强的水提取杜仲叶中绿原酸[12-13]。然而，绿原酸在强极性溶剂和高温下容易发生水解和分子内酯基迁移现象[14]，从而异构化形成新绿原酸和隐绿原酸，导致新绿原酸和隐绿原酸含量升高，绿原酸含量下降。为了强化提取效率和缩短提取时间，研究人员采用微波辅助提取法[15]、超声波辅助提取法[16]和生物酶法[17]等进行提取，这些方法在一定程度上改善了提取效果，但由于设备投资大，运行成本高，不适合工业化生产。除此之外，采用水提取法所提取绿原酸的杂质较多，加大了后续分离的成本。为此，有人尝试用极性适中的有机溶剂提取法，有机溶剂能够抑制植物酶对绿原酸的催化分解作用，减少水溶性杂质的溶出[18]。同时还发现，绿原酸在乙醇体系中比在甲醇、丙酮等有机体系中更加稳定，乙醇成为提取绿原酸的首选溶剂[19]。传统的单因素和正交设计试验误差较大，已不能满足杜仲叶的绿原酸提取工艺优化要求[20-21]，基于数学与统计学结合的响应面分析法不仅能够缩短优化时间，而且建模速度快，工程应用的可信度高[22]。为此，本文中以乙醇水溶液作为提取溶剂，在单因素试验基础上，通过响应面法分析乙醇浓度、料液比、提取温度等工艺参数对杜仲叶中绿原酸提取率的影响，旨在为优化杜仲叶绿原酸的提取工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

杜仲叶（湖南广源生物科技有限公司），绿原酸标准品（北京盛世康普化工技术研究院），其他试剂为分析纯（国药集团）。

1.1.2 主要仪器设备

UV-5100型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司），BT25S型电子天平（赛多利斯有限公司），101-2AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），FW135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），TDL-40B型高速离心机（上海安宁科学仪器厂），HWS-12型电热恒温水浴锅（上海一恒仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的制备

参考相关文献[23]，精密称取10.4 mg的绿原酸标准品，用40%乙醇溶液定容至10 mL，配制1.04 mg/mL的母液，再将母液分别稀释成5.2、10.4、15.6、20.8、31.2、41.6 μg/mL 的标准溶液。测定各标准溶液在325、345 nm的A325、A345值，求得ΔA。以吸光度ΔA为横坐标，绿原酸浓度C为纵坐标，绘制标准曲线，C＝47.281 0ΔA－0.510 5，R2＝0.999 3，说明标准曲线线型相关性良好。

1.2.2 样品检测

将杜仲叶在鼓风干燥机中烘干后粉碎，过筛，称取粉碎后的样品20.0 g置于500 mL烧杯中，加入280 mL 40%的乙醇水溶液，放于60 ℃恒温水浴锅中回流提取30 min后，滤液真空抽滤，然后将提取液5 000 r/min离心5 min，取上清液稀释50倍。以40%乙醇溶液为参比，用紫外分光光度计测定A325、A345值，求出提取液中的绿原酸含量。

1.2.3 稳定性测定

将待测样品置于室温下24 h，再进行吸光度测定，结果见表1。由表1可知，各样品在40%乙醇溶液中的吸光度值变化不大，说明各样品在40%乙醇溶液中表现稳定。

表1 样品放置24 h后吸光度变化Table1 Changes of absorbances of placed samples after 24 h

1.2.4 单因素试验设计

称取20.0 g杜仲叶粉末加入500 mL三颈烧瓶中，然后加入一定浓度的乙醇水溶液，加热至设定温度，回流提取一定的时间后，按照1.2.2方法检测提取液中绿原酸含量，分别考察乙醇质量分数（10%、20%、40%、60%、80%、100%）、温度（30、50、60、70、80、90 ℃）、时间（30、45、60、75、90、105 min）、料液比（1∶ 6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16）以及提取次数等因素对绿原酸提取率的影响。

1.2.5 响应面法优化设计

在单因素实验基础上，确定料液比、乙醇质量分数、提取温度3个因素及水平值，运用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken响应面设计和数据分析。料液比、乙醇质量分数、温度分别以A、B、C表示，每个因素的高中低水平分别以1、0、-1进行编码，各试验因素及水平值见表2。

表2 试验因素及水平Table2 Factors and levels of experiment

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇质量分数对绿原酸提取率的影响

在料液比1∶14、提取温度60 ℃、提取时间30 min条件下，考察不同乙醇质量分数对绿原酸提取率的影响，结果如图1所示。由图1可以看出，随着乙醇质量分数的增高，绿原酸的提取率呈先上升后下降的趋势，选择40%乙醇作为提取溶液质量分数。

图1 乙醇质量分数对绿原酸提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol mass fraction on extraction rate of chlorogenic acid

2.1.2 提取温度对绿原酸提取率的影响

在料液比1∶14、乙醇质量分数40%、提取时间30 min条件下，考察提取温度对绿原酸提取率的影响，结果如图2所示。由图2可知，在30～60 ℃之间，绿原酸提取率随着温度的升高而增加，达到60 ℃后，随着温度的进一步升高，绿原酸的提取率呈缓慢下降趋势。绿原酸为热敏性物质，在高温下容易失去活性，所以适宜的提取温度为60 ℃。

2.1.3 提取时间对绿原酸提取率的影响

在料液比1∶14、乙醇质量分数40%、提取温度60 ℃条件下，考察提取时间对绿原酸提取率的影响，结果如图3所示。由图3可知，绿原酸的提取率随着提取时间的增加而迅速增长，60 min时提取率最高，之后随着提取时间的增加提取率迅速降低，可能是随着提取时间的延长，部分绿原酸在高温下分解。因此，选择提取时间60 min。

图2 提取温度对绿原酸提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

图3 提取时间对绿原酸提取率的影响Fig.3 Effect of extraction duration on extraction rate of chlorogenic acid

2.1.4 料液比对绿原酸提取率的影响

在乙醇质量分数40%、提取时间60 min、提取温度60 ℃条件下，考察料液比对绿原酸提取率的影响，结果如图4所示。由图4可知，绿原酸的提取率随着料液比的增加而不断上升，当料液比为1∶14时提取率最大，随后趋于平稳。

2.1.5 提取次数对绿原酸提取率的影响

图4 料液比对绿原酸提取率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of chlorogenic acid

取杜仲叶粉20.0 g，在乙醇质量分数为40%、温度为60 ℃、料液比为1∶14的条件下提取60 min，并提取4次，如图5所示，绿原酸的提取率在2次提取后趋于稳定，所以选择2次作为提取次数。

图5 提取次数对绿原酸提取率的影响Fig.5 Effect of extraction times on extraction rate of chlorogenic acid

2.2 响应面法试验

2.2.1 响应值结果及其拟合模型

采用Box-Behnken中心组合试验设计原理，结合单因素试验结果，固定液料比1∶14，提取次数2次，分析乙醇质量分数、提取温度和提取时间对绿原酸提取率的影响。试验设计及结果如表3所示。

表3 响应面试验设计及结果Table3 Design and results of the response surface experiment

2.2.2 模型方程的建立及显著性分析

利用Design-Expert 8.0 Trial软件对表3中数据进行多元回归拟合，得表4。

表4 回归模型及其显著性检验Table4 Test of the regression model and its signiciances

当P值小于0.05时，表示此项指标显著，说明自变量和响应值之间线性关系显著。各因素经回归拟合后，得回归方程：

其中，Y为提取率，A为料液比，B为乙醇质量分数，C为温度。

由方差分析结果可知，该回归方程呈极显著性（P＜0.01），模型失拟项也呈极显著性（P＜0.01）。B、C2对绿原酸提取率的影响极显著（P＜0.01），B2对绿原酸提取率的影响显著（P＜0.05），A、C、AB、AC、BC、A2对绿原酸提取率的影响不显著（P＞0.05）。

2.2.3 响应曲面分析

根据回归分析结果，做出响应面图，如图6～8所示。由图6可知，在各料液比中，随着乙醇质量分数的增加，绿原酸的提取率开始快速增加而后减缓。由图7可知，在各料液比中，随着提取温度的增加，绿原酸的提取率先上升后下降，可能是由于绿原酸为热敏性物质，随着温度的升高绿原酸分解，从而导致提取率下降。由图8可知，在乙醇质量分数较低时，随着温度的增加绿原酸的提取率先上升后下降；在乙醇质量分数增大为40%～60%时，提取率达最大；随着乙醇质量分数的进一步增加，持续提高温度，提取率下降。

图6 料液比和乙醇质量分数对绿原酸提取率的影响Fig.6 Effect of solid-liquid ratio and ethanol mass fraction on extraction rate of chlorogenic acid

图7 料液比和提取温度对绿原酸提取率的影响Fig.7 Effect of solid-liquid ratio and extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

图8 乙醇质量分数和提取温度对绿原酸提取率的影响Fig.8 Effect of ethanol mass fraction and extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

2.2.4 提取工艺条件检验

考虑到实际情况，将提取工艺条件修改为料液比1∶11，乙醇质量分数40%，提取温度61 ℃。采用修正条件进行试验，得绿原酸实际提取率为0.870 8%，与0.872 8%相比，相差0.23%，说明此方程与实际情况拟合良好，所建模型可靠。

3 结论与讨论

通过响应面优化杜仲叶中绿原酸的提取工艺，获得最佳提取条件：料液比1∶11、乙醇质量分数40%、提取温度61.42 ℃。在此工艺条件下绿原酸提取率为0.872 8%。3个工艺条件对绿原酸提取率影响程度由大到小依次为乙醇质量分数、料液比、提取温度。考虑到实际操作的限制，将提取工艺条件参数修改为料液比1∶11，乙醇浓度40%，提取温度61 ℃。采用修正条件进行试验，结果与理论预测值基本一致。

为了进一步提高杜仲叶中绿原酸的提取效率，除了微波和超声波辅助外，还可以通过一些生物技术来改善提取效果。如陈晓娟等[24]分别通过酶法和半仿生法从杜仲叶中提取绿原酸，提取率达到1.44%和1.29%；刘艺等[25]通过超临界流体萃取绿原酸，避免了提取过程中高温氧化分解绿原酸；余少冲等[26]采用罐组动态逆流提取技术提取绿原酸，提取率是传统单罐提取的2.3倍。温度对绿原酸的稳定性和提取效率起到双重影响的作用，一方面，温度的维持不利于绿原酸的稳定，另外一方面，升高温度有利于提高绿原酸的表观活化能，加快绿原酸扩散至杜仲叶颗粒表面，增加其在溶剂中的溶解度，进而提高绿原酸提取率[27]。因此，还需进一步探讨温度和乙醇对绿原酸的浸出动力学原理，绿原酸粗提工艺也需要向精提工艺转变。

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