GB 4789.15－2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》标准解读

马群飞

2016年11月18日，国家卫生和计划生育委员会网站公布了一系列食品安全国家标准，其中GB 4789.15－2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（以下简称2016版标准）实施日期为2017年4月19日[1]。这个标准方法在目前各个食品检验机构和企业微生物实验室使用频率比较高。在2016版标准的前言中，虽然描述了对GB 4789.15－2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》[2]修改的主要章节，但是没有明确是如何修订的。因为在具体操作细节方面要求更为细致，检验机构困惑较多，实际工作中也可能出现偏差，影响标准的实施效果。为了帮助微生物检验人员更好地理解标准的变化，我们对2016版标准进行解读。

1 范围

2016版标准的前言中，没有描述对于“范围”这个章节进行了修改。除了将原来使用的术语“霉菌和酵母菌”按照标准名称统一规范为“霉菌和酵母”外，标准规定“第二法适用于番茄酱罐头、番茄汁中霉菌的计数。”此处“罐头”这个名词运用的不准确。实际上，只要是番茄酱、番茄汁，无论是否罐头，或其他包装形式，都适用于第二法检验。

2 设备和材料

2016版标准将均质器类型明确为拍击式均质器或均质袋（2.2）。以往版本标准是规定采用振荡的方式来进行样品表面的冲洗，均质程度不足。另外有些检验机构，使用旋转刀片均质器，可能会把霉菌的菌丝切断，导致检验结果偏高。所以，2016版标准对均质方式进行了明确的规定。无菌试管规格由10 mm×75 mm修改为18 mm×180 mm（2.6）。使用较为粗大的试管，有利于样品稀释液的混匀，否则在小试管里面很难充分混匀。增加了微量移液器及吸头1.0 mL（2.11），这是为了兼容检验机构实际工作中常用的方式。建议购买可整支高压灭菌的移液器，避免因反复吹吸导致微生物污染。删除了500 mL无菌广口瓶、牛皮纸袋这一类包装材料，原因是现在检验机构的使用率很低。删除了标准中没有用到的冰箱和恒温振荡器，增加了漩涡混合器和恒温水浴。主要是反复吹吸方式混匀样品稀释液，容易形成有害气溶胶，并增加污染机会，用漩涡混合器可以保证样品稀释液的均匀，减少污染。恒温水浴主要为了准确控制倾注琼脂的温度。对于郝氏计测玻片（2.13），还是沿用了以往的翻译习惯，但缺少了相应的英文描述，容易引起歧义，最好是描述为“郝氏（Howard）计测玻片”。

3 培养基和试剂

2016版标准中增加了生理盐水和磷酸盐缓冲液，保留无菌蒸馏水作为稀释液。增加两种稀释液，也是为了配合实验室工作，因为经常是同一份食品样品，需要同时检验菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母等等多个微生物项目。若每一份都重新称重更换稀释液，实验室工作量太大，也难以保证落实。而生理盐水和磷酸盐缓冲液对于生物细胞的保护作用明显优于无菌蒸馏水。实际上，仅仅是检验高盐食品（如水产调味品、腌菜等）时，无菌蒸馏水可能更适用。另外，将“马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基”书写方式改为“马铃薯葡萄糖琼脂”，“孟加拉红培养基”改为“孟加拉红琼脂”。

4 检验程序

流程图稍有修改。蒸馏水改为稀释液，明确了样品匀液的添加方式，以及培养基添加量明确在20 mL以上。

5 操作步骤

5.1 样品的稀释

本条除了稀释步骤，还规定了样品接种和空白对照。所以，本条标题应该是“样品稀释和接种”。另外，5.1.1对于固体和半固体样品的稀释，允许“充分振摇”。这样描述，会导致一些检验机构对于块状食品样品振摇后就进行下一步操作，微生物还没有从食品团块中释放出来，影响检验效果。2016版标准中，除了增加了生理盐水及磷酸盐缓冲液外，还将每平皿中马铃薯葡萄糖琼脂和孟加拉红琼脂的添加量由15 mL～20 mL改为20 mL～25 mL（5.1.6），这是为了符合GB 4789.28－2013《食品安全国家标准 食品微生物检验 培养基和试剂的质量要求》对于培养时间超过48 h的培养基应倾注4 mm左右的厚度和20 mL以上量的强制性规定[3]。增加了“置水平台面待培养基完全凝固”的规定。虽然标准规定梯度稀释时可以用无菌吸管反复吹吸，但是为了避免形成有害气溶胶，减少污染机会，建议检验机构尽量使用漩涡混合器来混匀稀释液。

5.2 培养

2016版标准将培养方式修改为平板应正置培养，是为了避免在培养过程中，因为需要多次观察而反复上下反转平板导致霉菌孢子扩散形成次生小菌落，最终影响计数结果。把“培养5 d，观察并记录”修改为“观察并记录培养至第5 d的结果。”避免培养到5 d后才进行观察，而出现霉菌菌落已经蔓延无法计数甚至导致培养箱污染的情况。因为光照会促进孟加拉红分解，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）的霉菌和酵母检验方法也专门规定在暗处培养[4]，所以，虽然2016版标准中未规定，检验机构也应避免使用透明门的培养箱或将平板放在有光照的条件下培养。

5.3 菌落计数

将上一个版本“霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计”这个错误规定修改为“霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌落蔓延”。本条的主要技术问题是如何“根据菌落形态分别计数霉菌和酵母”，毕竟霉菌和酵母不是分类学的名词，单从菌落外观进行区别判定容易引起争议。而在ISO标准中，就有较为明确的描述[5]。在被2016版标准替代的SN/T 2552.3－2010《乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第3部分：酵母、霉菌菌落计数》中，规定“排除可能生长的异常细菌菌落。必要时，根据形态学特征区分酵母和霉菌菌落”[6]，这样的描述似乎更合理。毕竟某些细菌可能耐受抗生素而形成菌落造成计数干扰，通过形态学特征（如低倍镜检等）可以区分霉菌和酵母及细菌菌落。FDA和ISO的标准方法也有类似要求[4-5]。建议检验机构通过作业指导书形式来完善这部分步骤。

6 结果与报告

6.1 结果

增加了两种结果的计算方法：若有两个稀释度平板上菌落数均在10 CFU～150 CFU，则按GB 4789.2的公式进行计算（6.1.2）[7]。因为这种情况还是比较经常出现的。若所有稀释度的平板菌落数均不在10 CFU～150 CFU，其中一部分小于10 CFU或大于150 CFU时，则以最接近10 CFU或150 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算（6.1.6）。这些都是原来标准没有规定的。

6.2 报告

以前的霉菌和酵母计数标准中，对计数结果的最终报告方式缺少详细的规定。2016版标准参照了GB 4789.2的计数方法[7]，增加了“若空白对照平板上有菌落出现，则此次检测结果无效”的内容（6.2.3）。明确了“菌落数在10以内时，采用一位有效数字报告”（6.2.1）。上个版本，是规定“菌落数在100以内时，按照四舍五入原则修约，采用两位有效数字报告。”例如有的检验机构就按照这样的规定，将10以内的菌落数报告成8.5。

7 操作步骤（第二法 霉菌直接镜检计数法）

这个章节，主要是增加了7.6报告条款，明确了最终的报告方式为“视野%”。存在的问题，一是“7.3 涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的摊布于计测室，以备观察”。这里的“标准液”，其实应该是“样品稀释液”。二是“7.5 结果与计算：……或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6（即测微器的一格）时即记录为阳性（＋）”，实际上，标准视野的1/6并不是测微器的一格。这两处都属于描述错误。

8 附录A 培养基及试剂

2016版标准的这个章节中，增加了生理盐水、磷酸盐缓冲液配方。其余技术性修改，主要是将马铃薯葡萄糖琼脂和孟加拉红琼脂的灭菌时间由2010版本的20 min修改为15 min（A.2.2、A.3.2），并增加了对孟加拉红琼脂避光保存备用的要求，因为太长时间的高压灭菌可能会破坏糖类，光照会促进孟加拉红分解。另外，删除了2010版本“倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中”的规定[2]，因为氯霉素能够耐高压灭菌，可以直接添加在培养基中再杀菌，这样就简化了相对繁琐的配制步骤。

9 存在的问题

2016版标准依然没有解决两个技术问题：一是没有改变使用28℃培养，与美国FDA或ISO标准用较低温度（25℃）培养的技术性差异问题[4，5，8]；二是没有明确如何区分霉菌和酵母的菌落形态分别计数报告的问题。期待随着检验技术的不断进步，未来版本的标准能够予以解决。

[1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. GB 4789.15－2016. 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数[S]. 2016. 引用时间：20170419. 网址：http://bz.cfsa.net.cn/staticPages/32AA7ED2-89E4-4660-8194-C5FC7EE00856.html.

[2] 中华人民共和国国家卫生部. GB 4789.15－2010. 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数[S]. 2010.引用时间：20170808. 网址：http://bz.cfsa.net.cn/staticPages/F39FC94AC37D-44D6-A3A7-2997FEAA7B5F.html.

[3] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. GB 4789.28－2013. 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求[S]. 2013. 引用时间：20170808.网址：http://bz.cfsa.net.cn/staticPages/3B34B8D6-7164-4419-B308-6AF683E8B606.html.

[4] Food and Drug Administration.Bacteriological Analytical Manual Chapter 18: Yeasts，Molds and Mycotoxins[S].2001. 引用时间：20170808. 网址：https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm071435.html.

[5] International Organization for Standardization. ISO 21527-1:2008.Microbiology of food and animal feeding stuffs － Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds － Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0，95[S].2008. 引 用 时 间：20170808. 网 址：https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:21527:-1:ed-1:v1:en.

[6] 中华人民共和国国国家质量监督检验检疫总局. SN/T 2552.3－2010.乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第3部分：酵母、霉菌菌落计数[S]. 2010. 引用时间：20170808.网址：http://www.eshian.com/standards/18265.html.

[7] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，中华人民共和国国家食品药品监督管理总局. GB 4789.2－2016. 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定[S]. 2016. 引用时间：20170808. 网址：http://bz.cfsa.net.cn/staticPages/F23DE741-721F-4C68-BDB1-F42440C66858.html.

[8] International Organization for Standardization. ISO 6611:2004.Milk and milk products—Enumeration of colony-forming units of yeasts and/or moulds—Colony-count technique at 25℃ [S]. 2004. 引用时间：20170808. 网址：https://www.iso.org/standard/40473.html.