发酵蔬菜中乳酸菌降解亚硝酸盐的研究进展

姚 荷，谭兴和*，张春艳，王 锋，李清明，王栏树，成才良

（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南佳宴食品有限公司，湖南 长沙 410000）

亚硝酸盐（nitrite，NIT）广泛存在于食品中，因其发色、保持风味、抗氧化和抑制致病菌生长等特性，经常被用作食品添加剂。但过量摄入亚硝酸盐会引发机体中毒、高铁血红蛋白症和癌变等[1]。据调查，超过80%的硝酸盐和亚硝酸盐摄入与蔬菜及其相关制品有关，其中发酵蔬菜尤甚[2-3]。蔬菜发酵是以蔬菜为原料、利用有益微生物活动，并控制一定生产条件进行蔬菜保藏的一种方式，在我国已有上千年的历史。其制品品种多样、风味独特、营养丰富，具有促消化、抑菌、抗老化等功效[4-5]。传统蔬菜发酵多为自然发酵，利用蔬菜、水、发酵材料自身所带乳酸菌进行发酵[6]。但自然发酵品质不一、发酵周期长、杂菌较多，存在亚硝酸盐含量超标的现象，严重危害人体健康。为解决这些问题，目前多采用人工接种乳酸菌进行蔬菜发酵。乳酸菌在蔬菜发酵中起主导作用，因其不带有硝酸还原酶，被认为是无毒、无害的益生菌。通过乳酸菌发酵，不仅可以改善发酵环境、缩短发酵周期、抑制杂菌生长、促进肠道蠕动以及营养吸收[7-8]，还可显著降低发酵蔬菜中亚硝酸盐含量，弥补自然发酵的缺陷[9-10]。JI F D等[11]研究表明，接种乳酸菌发酵白菜相比自然发酵，亚硝酸盐含量及其峰值明显降低。本文就发酵蔬菜中亚硝酸盐的来源、乳酸菌降解亚硝酸盐的途径以及影响发酵蔬菜中乳酸菌降解亚硝酸盐的因素进行了探讨，并对今后实际生产中，利用发酵蔬菜中乳酸菌降解亚硝酸盐研究趋势进行了展望。

1 发酵蔬菜中亚硝酸盐的来源及危害

蔬菜经自身氮循环、过量施用氮肥、田间采收贮藏等累积了大量的硝酸盐。硝酸根离子具有较低的急性毒性，但在长期贮藏和发酵过程中，经硝酸还原菌的作用，可转化为具有较高急性毒性的亚硝酸盐[12-13]。人体在食用刚腌制或不新鲜的蔬菜时，会导致亚硝酸盐摄入过量，继而引发机体中毒，出现头晕无力、胸闷气短、恶心腹泻等症状，严重者会呼吸衰竭，危及生命[14]。且大量具有强氧化性的亚硝酸盐进入血液后会改变血红蛋白正常形态，造成高铁血红蛋白症；也会干扰人体对维生素A的吸收，导致血脂下降，心跳过速等；并在人体内经一系列代谢活动生成致癌性极强的亚硝基化合物[15]，增加了胃癌、婴儿畸型的风险[16-17]。成人摄入0.3～0.5g亚硝酸盐即可引起中毒，摄入3g会导致死亡。操作不规范、卫生条件差的发酵蔬菜中多存在亚硝酸盐含量超标的现象，这严重制约了发酵蔬菜行业的发展。2012年，世界卫生组织（world health organization，WHO）已将发酵蔬菜列入致癌物质清单中[18]。2017年，世界卫生组织国际癌症研究机构在二类致癌物清单中公布，在导致内源性亚硝化条件下摄入的硝酸盐或亚硝酸盐属2A类致癌物。国标GB 2762—2017《食品中污染物限量》规定，蔬菜及其制品中腌渍蔬菜所含亚硝酸盐的限量不得超过20 mg/kg[19]。

2 发酵蔬菜中乳酸菌降解亚硝酸盐的机理

发酵初期，发酵液中含有的氧使杂菌迅速生长繁殖，产生的硝酸还原酶将发酵蔬菜中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，致使亚硝酸盐含量急剧增加[20]。乳酸菌在蔬菜发酵过程中会代谢产生乳酸、酒石酸和亚硝酸还原酶等[21]，使发酵环境的pH下降，从而抑制酶活和杂菌生长[22-23]。亚硝酸还原酶和酸性环境（pH＜4.0）是发酵蔬菜中亚硝酸盐降解的主要原因，此外，乳酸菌产生的细菌素也在其中起着重要作用。

2.1 酶降解

乳酸菌在蔬菜发酵的过程中会产生大量的代谢产物，其中就包括亚硝酸还原酶。研究表明，亚硝酸还原酶可有效的降解亚硝酸盐。张庆芳等[24]对乳酸菌降解亚硝酸盐机理进行了研究，得知在发酵前期，发酵液的pH＞4.5时，乳酸菌对亚硝酸盐的降解以亚硝酸盐还原酶降解为主。张馨月等[25]用电子捕获-气相色谱（electron capture-gas chromatography，EC-GC）法和靛酚蓝染色法确定亚硝酸盐的降解途径，并通过测定干酪乳杆菌鼠李糖亚种（Lactobacillus caseisubsp.rhamnosus）6013细胞中不同组分的酶活研究了亚硝酸盐还原酶的定位。实验中，随着NaNO2的降解，产物中产生N2O气体，没有NH4+。表明LCR 6013能有效降解亚硝酸盐是源于细胞内亚硝酸盐还原酶的作用，最可能通过反硝化路径NO2-→NO→N2O→N2进行降解，而非铵化作用。亚硝酸还原酶大多是胞间酶，其降解亚硝酸盐的效果极易受到温度和pH的影响。龚钢明等[26]在研究乳酸杆菌（Lactobacillus）C2亚硝酸盐还原酶制备时，对酶学性质的分析表明，亚硝酸盐还原酶最适温度30℃，最适pH 5.5，在低于30℃和酸性环境中，酶活受到抑制，但仍保留活性，但在50℃以及碱性环境中时，酶活性消失。卢海强等[27]从自然发酵的酸菜样品中获得1株高产亚硝酸还原酶的冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum）R11，并经过发酵特性的初步研究表明，该菌最适生长温度为20℃，且能够在较低的温度条件下正常生长，能够满足酸菜低温发酵需求。此外，其还拥有较好的产酸能力。蔬菜发酵环境的多变会影响乳酸菌和亚硝酸盐还原酶的活性，继而影响发酵前期亚硝酸盐降解效果，因此筛选抗逆性强的产亚硝酸盐还原酶的乳酸菌对蔬菜发酵产业至关重要。

2.2 酸降解

蔬菜发酵过程中，乳酸菌利用糖类代谢产生大量酸，发酵环境的pH不断降低[28]，使得亚硝酸盐还原酶的活力下降，亚硝酸盐的降解由酶降解转为酸降解。YANG H等[29]研究表明，酸菜发酵12 d后pH值由7.3降至4.0，之后保持在pH4.1左右；发酵第6天出现亚硝峰，之后亚硝盐含量不断降低，其中6～18 d尤甚。因此可知，当pH降至5.5（第6天）后，亚硝酸盐降解以酸降解为主。林浩[30]利用不同pH的乳酸溶液，观察植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）对亚硝酸盐的降解效果。发现当溶液初始pH值＞5.0时，亚硝酸盐降解率在24 h内＜20%，降解效果不显著。当溶液初始pH≤4.0时，亚硝酸盐含量下降明显，其中初始pH为3.0时，亚硝酸盐含量下降速率很快，在24 h后降解率可达87.29%，降解效果良好。此结果表明，当培养液中pH≤4.0时，植物乳杆菌对亚硝酸盐的降解以酸降解为主。李春等[31]分析乳酸菌降解亚稍酸盐的可能机制，观察到乳酸杆菌发酵至pH≤4.0时，亚硝酸盐含量下降急剧加快，当达到发酵终pH 3.6时，亚硝酸盐降解率接近100%。从此结果可初步判定，乳酸菌降解亚硝酸盐过程中，酸可能是引起亚硝酸盐降解的主要因素，且当pH≤4.0时，酸降解效果尤为明显。酸性发酵环境抑制了杂菌的生长繁殖和硝酸还原酶的活力，且H+与亚硝酸盐发生非酶歧化反应，这些都促使了亚硝酸盐含量的降低。因此，在满足发酵蔬菜色、香、味的前提下，适当降低发酵初期pH是减少亚硝酸盐含量的有效方式。

2.3 乳酸菌素

乳酸菌素是由乳酸菌核糖体产生并分泌到胞外的一类抗菌肽，能抑制一些亲缘关系相近的细菌，其可防止食品腐败和致病菌的生长，继而降低蔬菜发酵过程中硝酸还原酶活性和亚硝酸盐含量[32]。乳酸菌素被认为是食品的天然保护剂[33-34]，目前，乳酸链球菌素（nisin）是应用最广泛的乳酸菌素[35]。JIANG J等[36]从中国传统发酵萝卜中分离到一株产细菌素的新菌株清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）LSJ618，其产生的一种脂蛋白可抑制食品腐败菌和食源性致病菌的生长，包括革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）、李斯特氏菌（Listeria）和革兰氏阴性菌变形杆菌（Proteus）、大肠杆菌（Escherichia coli），但并没有抑制大多数乳酸菌。此细菌素耐酸、耐低温，且在发酵过程中降解较少，可用作生物防腐剂。韩新锋等[37]以产细菌素植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）P158纯种半固态发酵制作什锦泡菜，并与传统自然发酵泡菜对比发现，接种发酵泡菜中细菌数、霉菌、大肠菌群数量均显著低于自然发酵泡菜，乳酸菌活菌数量明显高于自然发酵泡菜，其中，接种发酵泡菜发酵过程中pH值下降最迅速、亚硝酸盐含量低于自然发酵，且无明显亚硝酸盐高峰。由此可知，乳酸菌素可抑制发酵蔬菜中有害菌生长，并间接降低了发酵过程中亚硝酸盐含量。LIU W L等[38]对接种产细菌素Y31的屎肠球菌（Enterococcus faecium）Y31发酵白菜和自然发酵白菜进行分析发现，接种Y31的白菜发酵速度更快、乳酸菌群数量更多、细菌素Y31产量更高、杂菌数量更少，且发酵液中亚硝酸根一直保持较低含量。因此，产细菌素Y31的屎肠球菌Y31作为一株安全菌株，与自然发酵相比，可有效地控制腐败和病原微生物，降低亚硝酸盐浓度，维持发酵蔬菜安全。

3 影响发酵蔬菜中乳酸菌降解亚硝酸盐的因素

蔬菜在发酵过程中，乳酸菌对亚硝酸盐降解情况受诸多因素影响，因此，可通过调节这些影响因素来控制亚硝酸盐降解率，以得到安全美味的发酵蔬菜。

3.1 原材料

发酵开始前，体系中原材料及添加物会影响蔬菜发酵过程中亚硝酸盐含量。闫亚梅等[39]以大白菜为主料，测定了不同蔬菜组合（白萝卜、胡萝卜、黄瓜、豇豆）自然发酵过程中亚硝酸盐含量变化，发现亚硝峰的变化范围为12～60 mg/kg，蔬菜种类越多，亚硝峰越低，即大白菜＋豇豆＋白萝卜＋胡萝卜＋黄瓜组合，亚硝峰最低是13mg/kg。食盐可以调节发酵蔬菜口感、抑制细菌生长。熊涛等[40]以添加了2g/100mL、5g/100mL、8g/100mL食盐的自然发酵泡菜为研究对象，比较了不同食盐添加量的泡菜中优势菌系结构和亚硝酸盐含量的变化，发现乳酸菌是泡菜发酵的优势菌种，2 g/100 mL食盐的泡菜中乳酸菌的繁殖最快；5 g/100 mL食盐能较好地抑制有害微生物的繁殖，最快出现亚硝峰，1 d即可稳定；而8 g/100 mL食盐抑制了泡菜中乳酸菌的繁殖，延迟了泡菜的成熟期。糖类的加入为乳酸菌发酵蔬菜提供碳源，同时也可成就发酵蔬菜的风味。高洁荣等[41]研究了不同浓度绵白糖（0、2%、4%、6%、8%）对白菜自然发酵过程中亚硝酸盐含量的影响。结果表明，当添加4%的绵白糖时发酵白菜的亚硝峰最早出现、最快达到稳定且亚硝酸盐含量最低，感官品质最佳。

3.2 发酵条件

乳酸菌最适温度为30～40℃，最适pH为5.5～6.5，因此发酵温度和pH都影响乳酸菌降解亚硝酸盐情况。田陈聃等[42]以甘蓝为原料，研究不同发酵温度（10℃、20℃、30℃）对自然发酵过程中亚硝酸盐含量的影响，发现30℃时，亚硝峰出现的最早且峰值大，然后下降至3个发酵温度中最低。苏肖晶[43]在MRS培养基中研究了温度、pH值、乳酸菌接种量对乳酸菌降解亚硝酸盐含量的影响，发现随着温度升高，亚硝酸盐的降解率逐渐增加，35℃降解效果最好，之后温度升高降解率开始下降；pH值在5.5时，亚硝酸盐降解效果最好，pH＜4.5条件下，对亚硝酸盐的降解作用降低，说明此pH下，乳酸菌活性受到抑制；随接菌量的增加，亚硝酸盐降解率也逐渐增加，说明增加发酵体系中乳酸菌量可以提高亚硝酸盐的降解量。柴政等[44]研究了添加不同浓度食醋（0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%）对泡白菜中微生物数量和亚硝酸盐含量的影响。结果表明，相比不加食醋的泡白菜，加入食醋的泡白菜中乳酸菌数较高，肠道菌数低且总体呈下降趋势，至第6天基本消失，亚硝峰低且变化不明显。说明食醋能抑制亚硝酸盐生成菌的生长繁殖，并加快乳酸菌降解亚硝酸盐速度，促进泡白菜的成熟。

4 展望

亚硝酸盐广泛存在于发酵蔬菜中，对人体健康危害极大，乳酸菌降解亚硝酸盐是一种安全的生物降解法。因此，寻找能够快速降解亚硝酸盐、加速发酵蔬菜成熟且抗逆性强的乳酸菌是一个重要的研究方向。使用更快速、准确的新设备追踪蔬菜发酵过程中乳酸菌与亚硝酸盐降解具体联系及代谢产物对发酵体系的具体影响，如更多种乳酸菌素的研究发现。目前对于发酵蔬菜中乳酸菌降解亚硝酸盐的研究只是实验室小规模化研究，应逐渐将其转变成大型工厂化生产，满足生产需求。