肝细胞生长因子诱导非小细胞肺癌耐药研究

刘丹丹 王莉彦 许尔屹 赵伟华

在肺癌患者中非小细胞肺癌约占85%～90%的比重[1]，因其具有较高发病率并具有较高生命风险，促使有关临床研究不断增多[2-3]。吉非替尼是非小细胞肺癌化疗的常见分子靶向药物，但其仅对部分患者能够发挥良好效用，临床应用时常出现耐药性等表现[4]。本研究分析肝细胞生长因子诱导敏感非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的耐药情况，分别选择PC-9与H292敏感非小细胞肺癌作为试验对象，观察细胞增殖、凋亡、细胞周期对吉非替尼耐药情况，预期能够明确肝细胞生长因子诱导对肿瘤耐药的影响，从而有效改善化疗实施效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用上海慧颖生物科技有限公司提供的PC-9人肺癌细胞与H292人肺癌细胞，上海博升生物科技有限公司提供的肝细胞生长因子，英国AstraZeneca UK Limited生产的吉非替尼片（产品批号为：LX767），福州迈新生物科技有限公司提供的鼠抗人p-EGFR、c-MET与p-MET试剂盒。

1.2 方法

提取2种不同类型非小细胞肺癌细胞分别经过PBS洗涤，再将其置入含10 ml胎牛血清的培养基中，以37℃、5%CO2环境下孵育，每隔72 h对其进行换液传代。将10 μg肝细胞生长因子稀释至浓度为100 μg/ml的待检液，采用DMSO溶液对吉非替尼药物进行稀释处理，其浓度控制为50 μmol/ml。首先，开展细胞活性与药物半数抑制浓度的检验，精称100 ml细胞混悬液进行接种，再滴入肝细胞生长因子母液100 μl与吉非替尼母液100 μl，培养3 d时分别在各孔中滴入蒙脱土（MTT） 20 μl，持续孵育4 h后行离心处理再滴入二甲基亚砜（DMSO） 200 μl使其充分混合、溶解。应用酶标仪测定其吸光度，并计算细胞存活率。提取肺癌细胞接种6孔板中，行2次PBS清洗后再滴入肝细胞生长因子母液与吉非替尼母液，持续培养2 d。收集培养液行离心处理再进行2次PBS洗涤，给予固定120 min后行2次PBS洗涤，滴入标记液500 μl，孵育30 min，再应用流式细胞仪开展细胞周期测定。采用相同方式处理肝细胞溶液，加入肝细胞生长因子母液与吉非替尼母液并行培养、离心、洗涤后再滴入Binging Buffer悬浮细胞500 μl与Annexin V-PE 5 μl，室温放置5 min后以流式细胞仪进行细胞凋亡测定。提取对数生长细胞进行裂解处理，离心处理后采集蛋白裂解液，采取BCA蛋白定量法，并应用Western blot法进行细胞蛋白测定。

1.3 统计学方法

数据处理应用SPSS 19.0统计学软件，半数抑制浓度等计量资料采用（±s）表示，以t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞活性与吉非替尼半数抑制浓度测定结果

PC-9细胞接受吉非替尼处理的半数抑制浓度为（0.05±0.02）μmol/L，H292细胞接受吉非替尼处理的半数抑制浓度为（0.18±0.04）μmol/L，组间比较差异具有统计学意义（t=5.18，P＜0.05）。吉非替尼浓度为0.01、0.04、0.1、0.4与1 μmol/L时，PC-9细胞存活率分别为80%、51%、42%、40%、39%，H292细胞存活率分别为84%、65%、50%、44%、42%，通过提高药物浓度后细胞存活率不断降低，表明两种细胞接受药物处理后的生长抑制效果与药物浓度呈负相关性。同时，两种细胞接受肝细胞生长因子与吉非替尼处理后其半数抑制浓度有所上升。

2.2 肝细胞生长因子诱导对吉非替尼耐药的测定结果

PC-9细胞对照标本存活率为100%，单用吉非替尼处理后其细胞存活率为52%，采用肝细胞生长因子诱导与吉非替尼处理后其细胞存活率为61%；H292细胞对照标本存活率为100%，单用吉非替尼处理后其细胞存活率为51%，采用肝细胞生长因子诱导与吉非替尼处理后其细胞存活率为72%，表明肝细胞生长因子在两种细胞对吉非替尼耐药方面有诱导作用。

2.3 肝细胞生长因子诱导对细胞凋亡与细胞周期的影响

单纯应用吉非替尼处理后H292细胞未见明显细胞凋亡，处理前细胞凋亡率为8.4%，处理后细胞凋亡率为8.1%；PC-9细胞凋亡有促进表现，处理前细胞凋亡率为13.2%，处理后凋亡率为16.7%；观察PC-9细胞接受肝细胞生长因子诱导与吉非替尼处理后其凋亡率有所降低，处理后凋亡率为8.3%。经肝细胞生长因子诱导对PC-9细胞与H292细胞周期无明显影响。

2.4 细胞蛋白测定结果

Western Blot检验表示肝细胞生长因子对两种肺癌细胞c-MET磷酸化均有刺激作用。肝细胞生长因子诱导前H292细 胞 c-MET表 达 为（0.122±0.013）， 磷 酸 化 c-MET表达为（0.135±0.024）；诱导后H292细胞c-MET表达为（0.147±0.019），磷酸化c-MET表达为（0.203±0.029），诱导前后H292细胞c-MET表达比较差异无统计学意义（P＞0.05），但诱导前后磷酸化c-MET表达比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。肝细胞生长因子诱导前PC-9细胞c-MET表达为（0.142±0.021），磷酸化c-MET表达为（0.165±0.029）；诱导后PC-9细胞c-MET表达为（0.146±0.031），磷酸化c-MET表达为（0.219±0.018），诱导前后PC-9细胞c-MET表达比较差异无统计学意义（P＞0.05），但诱导前后磷酸化c-MET表达比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。研究结果表现经肝细胞生长因子诱导后两种细胞的磷酸化c-MET表达明显提高。

3 讨论

目前，国内临床已将吉非替尼作为非小细胞肺癌的常用化疗药物[5-6]，但部分患者存在耐药情况[7]，而临床对其形成机制尚不明确[8]。肝细胞生长因子是当前肿瘤学科研究热点内容[9]，报道表示癌症患者通常存在肝细胞生长因子表达上升表现[10]，并同其侵袭情况具有紧密关联[11-12]。本次研究分别选取了两种吉非替尼敏感的肺癌细胞，PC-9与H292细胞均排除了其药物耐药影响因素。试验结果表现两种细胞接受吉非替尼处理的半数抑制度分别为（0.05±0.02）μmol/L与（0.18±0.04）μmol/L，在增加用药浓度后两种细胞存活率均出现明显下降表现，体现其药物浓度越高细胞生长抑制作用越强，并且应用肝细胞生长因子诱导后两种细胞半数抑制浓度均明显升高。同时，应用肝细胞生长因子诱导后两种细胞存活率均有所下降，提示肝细胞生长因子在两种细胞对吉非替尼耐药方面有诱导作用。但肝细胞生长因子仅对PC-9细胞凋亡有所影响，对H292细胞凋亡及两种细胞周期均无显著影响。而Western Blot检验表示肝细胞生长因子对两种肺癌细胞c-MET磷酸化均有刺激作用，在肝细胞生长因子诱导后，H292与PC-9细胞的c-MET表达未发生显著改变，但诱导后两种细胞的磷酸化c-MET表达分别为（0.203±0.029）与（0.219±0.018），同诱导前相比较均明显升高，进而可推断其耐药作用机制或为刺激细胞c-MET磷酸化表达增强。