响应面分析灵芝菌糠发酵饲料加工调制与优化研究

刘 月， 李志涛， 李杰峰*， 赵志强， 刘军峰， 林冬梅

（1.河北省畜牧兽医研究所，河北保定 071000；2.江南大学，江苏无锡 214122；3.河北工程大学，河北邯郸 056001）

菌糠的主要成分是棉籽皮、农作物秸秆、玉米芯、锯木屑及残余菌丝体。目前，菌糠的处理方式大多数为焚烧或随意丢弃，少数用于食用菌栽培的二次培养料或开发成肥料，极少部分开发用作动物的饲料补充料。研究表明，菌糠中含有大量的粗蛋白质和丰富的糖类、有机酸类及其他营养物质，另外，菌糠中还含有大量的纤维素、半纤维素、木质素等抗营养因子，这些成分难以被畜禽直接消化利用（潘军，2010）。罗茂春等（2014）利用乳酸菌酵母菌制作白玉菇菌糠发酵饲料，菌糠发酵饲料的营养和感官品质均得到较大改善；通过进行正交试验，确定了最佳工艺条件为白玉菇菌糠：玉米粉 8∶1、发酵温度 30 ℃、乳酸菌:酵母菌 1∶2、菌液接种量2.5%，在此条件下白玉菇菌糠粗蛋白质含量为14.82%。张丽美等（2013）在菌糠中接入枯草芽孢杆菌对其发酵后，枯草芽孢杆菌的芽孢数为8×109cfu/g干重。灵芝收菇后的菌糠污染率小、获得率高，而且仅收一潮菇，菌糠中养分剩余率高、具有较丰富的碳源与氮源等特点。因此，本试验选取灵芝菌糠作为研究对象，将灵芝菌糠与玉米粉混合搭配，接入假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌混合菌液，进行厌氧发酵。通过Plackett－Burman与中心复合试验优化其发酵条件，为菌糠的合理开发提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 灵芝菌糠：邯郸市荣珍食用菌合作社提供。

菌种：高活性干酵母粉由安琪酵母股份有限公司提供，粉末固体，活菌量＞4×109cfu/g。嗜酸乳杆菌粉由常州生物科技有限公司提供，粉末状固体，活菌量＞4×109cfu/g。

发酵袋：具有单向排气阀装置，规格30 cm×20 cm，袋装容量1000 g。

1.2 灵芝菌糠营养成分分析 收集无污染、无霉变的灵芝菌糠进行粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪、无氮浸出物、钙、磷和灰分测定。测定方法依据国标和饲料分析检测常规方法进行。

1.3 灵芝菌糠发酵饲料制备

1.3.1 菌糠预处理 将选取的灵芝于65℃烘干、粉碎后过60目筛孔筛选，按比例加入玉米粉充分混合，将其作为发酵原料，121℃高压灭菌30 min后，装入发酵袋中待用。

1.3.2 菌液制备 假丝酵母菌液制备方法：配质量浓度为5 g/L葡萄糖活化溶液，调温至35℃，将高活性干酵母粉按照质量比溶解于活化液中，在33～35℃下活化1 h，得到假丝酵母菌液。

嗜酸乳杆菌液制备方法：配质量浓度为5 g/L葡萄糖活化溶液，调温至40℃，将嗜酸乳杆菌粉按照质量比溶解于活化液中，在37～40℃下活化30 min，得到嗜酸乳杆菌液。

混合菌液制备：将假丝酵母菌液和嗜酸乳杆菌液按照质量比混合均匀，得到混合菌液。

1.3.3 发酵 在发酵袋中按比例接入混合菌液，并按比例补充水分，调节pH，密封后在设定温度下发酵，按时取样测定，检验发酵效果。

1.4 方法

1.4.1 Plackett-Burman试验关键因子筛选 采用Plackett-Burman设计法对影响灵芝菌糠发酵后粗蛋白质含量的9个影响因素进行筛选，选用试验次数N＝12的试验设计，其9个影响因素分别为：灵芝菌糠和玉米粉质量比（X1）、假丝酵母菌液和嗜酸乳杆菌液质量比（X2）、菌液接种量（X3）、发酵袋装量（X4）、料水比（X5）、初始 pH（X6）、发酵温度（X7）、发酵湿度（X8）和发酵时间（X9），响应值为灵芝菌糠发酵后粗蛋白质含量。各因素及其代码、编码水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素及代码水平

1.4.2 最陡爬坡试验 响应面拟合方程只有在接近最佳值区域才近似真实情况，因此要先逼近此区域才能建立有效的响应面拟合方程，通常用最陡爬坡法快速的逼近最佳值区域。最陡爬坡法以Plackett-Burman试验结果为依据，爬坡路径与主要因素的效应一致（张晓萍，2010）。

1.4.3 发酵条件的中心组合优化 采用响应面中心组合设计（Box-Behnken design），对灵芝菌糠发酵后粗蛋白质含量的显著影响因子进一步优化，根据Plackett-Burman和最陡爬坡法试验结果，结合因素的效应大小和试验中的实际情况，选择下一步试验水平的中心点和各水平的步长（夏海涛，2014； 李 立 英 ，2012； 王 普 ，2006；Kalil，2000；Davies，1967），响应值为灵芝菌糠粗蛋白质含量，各因子和代码水平见表2。

表2 Box-Behnken design试验设计因素及代码水平

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验关键因子筛选 运用SAS软件对Plackett-Burman设计进行分析，由试验设计和结果（表3）及各因素水平和结果（表4）得知，模型 Pr＞F=0.048538＜0.05，表明响应面回归模型为显著水平，模型的校正系数R2＝0.9890，说明该模型方程拟合程度良好。模型的修正系数R2Adj=0.9395，表明该模型较好地反映了各因素之间的关系。各因素对灵芝菌糠粗蛋白质含量的影响大小依次为：X5、X6、X3、X2、X4、X9、X1、X8、X7（按回归系数绝对值大小排序），其中 X2、X3、X5、X6为显著水平，X1、X2、X3、X7、X8呈正效应， 而 X4、X5、X6、X9呈负效应。因此确定 X2、X3、X5、X6为 4 个主要因素进行最陡爬坡试验和Box-Behnken试验设计。Plackett-Burman试验设计回归方程为：

Y=17.03899+0.451667X2+0.175X3-0.634667X5-0.788889X6。

2.2 最陡爬坡试验 根据Plackett-Bueman试验筛选出的4个主要因素回归系数效应值的正负大小，设计爬坡方向和步长进行最陡爬坡试验以逼近最大区域。试验设计及结果如表5所示，由表5可知，灵芝菌糠粗蛋白质含量在试验5附近，故以第5组试验条件为水平中心点进行响应面设计。

2.3 发酵条件中心组合优化 在最陡爬坡试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选取X2、X3、X5、X6进行4因素3水平的响应面分析方法，以灵芝菌糠粗蛋白质含量为响应值，结果见表6。

采用SAS软件对试验数据进行回归分析，由此可求出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联式，得到回归方程式：

表3 Plackett-Burman试验设计与结果

表4 Plackett-Bueman设计回归方程系数及其显著性检验

表5 爬坡试验设计及结果

Y=-365.087+26.71917X2+23.1125X3+19.37X5+74.25X6-1.873333X2X2+0.64X2X3-1.08X2X6-1.584583X3X3-1.145X3X6-0.046383X5X5-5.753333X6X6。

对该回归模型进行方差分析，结果如表7所示，由此可知模型Pr>F=0.0001，表明响应面回归模型达到了极显著水平，模型的校正系数R=0.9566，说明该方程拟合程度良好。模型的修正系数R2Adj=0.9059，表明该模型较好地反映了各因素之间的关系。通过对回归方程的方差分析得出，一次项 X2、X3、X5、X6，二次项 X22、X32、X52、X62和交互项X2X3、X2X6、X3X6对灵芝菌糠粗蛋白质含量的影响是显著的，各试验因子对灵芝菌糠粗蛋白质含量的影响为非线性关系。

表6 Box-Behnken design试验设计与结果

根据上述回归方程和回归模型方差分析绘出响应曲面，见图1。两因素之间的影响呈抛物线型关系，且均有一个极大值点，变化趋势先增大后减小。通过求解回归方程得到灵芝菌糠发酵饲料的最佳工艺是：假丝酵母菌液和嗜酸乳杆菌液用量比6.781108∶1、菌液接种量6.774657%、料水比1.139045∶1和初始 pH 5.159828，灵芝菌糠粗蛋白质含量的预测值为14.883813%。考虑到实际操作，将试验的条件修改为假丝酵母菌液和嗜酸乳杆菌液用量比6.8∶1、菌液接种量6.8%、料水比1.1∶1 和初始 pH 5.2。

表7 回归模型方差分析

2.4 优化条件下灵芝菌糠发酵饲料验证结果在最佳组合条件下重复试验3次，测定实际灵芝菌糠粗蛋白质含量为14.51%，与预测值14.88%基本吻合，偏差较小，说明得到的回归模型和实际情况拟合较好，进一步验证了该模型的可行性具有实用价值。灵芝菌糠发酵前与发酵后营养含量和感官品质对比如表8所示。

3 讨论

本文通过以灵芝菌糠为发酵原料，接入混合菌种进行厌氧发酵，研究其制作发酵饲料的工艺条件。通过响应面分析法中Plackett-Burman试验设计，对影响灵芝菌糠发酵效果的诸多相关因素进行分析并成功筛选出主效应因子，在Plackett-Burman设计基础上，根据主效应因子作用大小与方向进行爬坡试验，得到以假丝酵母菌液和嗜酸乳杆菌液用量比6∶1、菌液接种量6%、料水比1∶1和初始pH 5为水平中心点进行响应面设计。通过Box-Behnken design中心复合试验，对主效应因子进一步优化。得到假丝酵母菌液和嗜酸乳杆菌液用量比、菌液接种量、料水比和初始pH对灵芝菌糠中粗蛋白质含量影响的最佳值。

经对灵芝菌糠发酵得到的熟料干燥后制成饲料颗粒成品进行营养成分分析，结果表明，除灰分几乎无变化外，其粗纤维由40.11%下降到29.85%，粗蛋白质由8.75%升高至14.51%，无氮侵出物由22.19%升高至25.92%。由此表明，灵芝菌糠经微生物发酵后，粗纤维可转化成蛋白质和单糖等无氮侵出物。因此，菌糠中粗蛋白质、无氮侵出物显著提高。

图1 试验因子交互作用对粗蛋白质含量的影响

利用菌糠制作发酵饲料，因选择的菌种组合、接种量和发酵条件等的不同，生产的发酵饲料营养成分差异较大。饲料加工、贮存和动物种类以及饲养条件等因素也存在差异，菌糠发酵饲料的实际应用效果差异也会很大。因此，筛选繁殖、抗杂菌能力强并对粗纤维有强大分解能力的菌种对不同菌糠发酵，研究其有效成分，并对菌糠发酵饲料适用动物种类以及添加量进行深入研究。

表8 灵芝菌糠发酵前后的营养价值表（烘干后测定）

4 结论

灵芝菌糠制作发酵饲料最佳制备工艺条件为假丝酵母菌液和嗜酸乳杆菌液用量比6.8∶1、菌液接种量6.8%、料水比1.1∶1和初始pH 5.2。在此条件下测得菌糠发酵饲料中粗蛋白质含量为14.51%，与理论预测值相比，相对误差仅为0.37%，说明模型能较好地预测灵芝菌糠发酵饲料粗蛋白质含量的实际情况，具有较好的生产指导意义。

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