一株粗糙脉胞菌的鉴定及产纤维素酶发酵工艺优化

张玲秀，白建华，郝瑞林，董社琴

（忻州师范学院生物系，山西忻州034000）

秸秆纤维素可再生、易获得，其相对于木质材料木质素含量低，对其工业利用中酶需求量和花费也较低，所以玉米秸杆作为一种优质生物能源材料，更具有商业利用价值（Banerjee等，2008）。

通过微生物产酶降解秸杆纤维素具有条件温和，无污染等优点，因此分离和筛选出针对不同行业的高效纤维素分解菌群，有望解决纤维素酶产量和活性不高，而成本偏高的问题 （张传富等，2007）。 粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）是木质纤维素天然降解真菌，具有良好的遗传操作手段和功能基因组工具，在纤维素降解、糖转运及全糖利用、纤维素酶表达分泌的分子基础等方面取得了显著进展（Jonathan 等，2010；Tian 等，2009）。 李建波等（2004）对粗糙脉孢菌乙醇发酵、黑色素分泌、木糖发酵等做了较为系统的研究。冯炘等（2005）通过优化设计确定了Neurospora crassa 1602菌株摇瓶发酵的最佳产酶单因素产酶条件。顾芮萌等（2012）以粗糙脉孢菌基因组测序菌株fgsc2489为对象，利用相应面法，对粗糙脉孢菌纤维素酶液体发酵培养基进行了优化。

目前，对粗糙脉胞菌产纤维素酶液体发酵培养条件工艺研究鲜有报道。本文以从忻州农田玉米秸杆中筛选的一株粗糙脉孢菌为对象，以玉米秸杆粉为碳源，首先进行单因素优化，进一步利用响应面法，对粗糙脉孢菌纤维素酶液体发酵工艺进行优化。旨在提高产纤维素酶量，为其进一步开发利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料 斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），自然pH。产纤维素酶培养基/L：玉米秸杆粉2%， 蛋白胨 5.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， 酵母粉 1 g，pH 自然。1.2 方法

1.2.1 菌种的鉴定 菌种的形态学分类鉴定参见魏景超（1979）方法。

真菌18SrDNA扩增鉴定：采用CTAB法提取总 DNA，PCR 扩增引物为 ITS1：5'TCCG TAGG TGAA CCTG CGG3'和 ITS4：5'TCCT CCGC TTAT TGATATGC3'。PCR反应条件为94℃预变性4min，然后进入循环，94℃变性1 min，55℃退火40 s，72℃延伸 90 s，共 35个循环，最后 72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，Image Lab 3.0软件分析。

1.2.2 CMC-Na酶活力测定 纤维素酶活力的定义（IU/mL）：指 1 min 催化底物生成 1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

Y=（D·n·1000）/T·V·M；

式中：D为生成的葡萄糖含量；由标准曲线得知，n为稀释倍数；T为反应时间，30 min；V为酶液体积，1 mL；M为葡萄糖的质量分数，180。

取两支试管（试验组和对照组），各加入2 mL 1%CMC-Na溶液，试验组加 0.5 mL稀释酶液，空白对照不加，混匀后置于50℃水浴，反应30 min，两试管都加入DNS试剂3 mL，空白管加入100℃煮沸10 min后失活的酶液0.5 mL，摇匀后将两管放入沸水浴加热10 min，取出迅速冷却到室温，空白管调零，在540 nm下测试验组吸光值，通过葡萄糖标准曲线计算还原性糖含量。

1.2.3 单因素及响应面法优化设计 单因素优化选取4个因素:培养时间、培养温度、转速、初始pH，以CMC-Na酶活力为指标，得到各因素最适水平，然后根据Box-Behnken设计原理，设计响应曲面分析试验，其因素水平编码见表1。

表1 因素水平编码

2 结果

2.1 rDNA-ITS序列测序与比对结果分析 基因扩增产物纯化后由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，菌种与从GENBANK获取的相似序列经DNAMAN软件进行比对分析并构建N-J系统发育树，如图1。

图1 粗糙脉孢菌QF的rDNA-ITS系统发育树

2.2 培养时间对产酶量的影响 将活化菌种接入培养瓶中，28℃连续培养7 d，每隔24 h检测一次酶产量，绘制产酶曲线。结果见图2，第5天产酶量最多，因而后续研究选择产酶最高的第5天进行分析。

图2 培养时间对产酶的影响

2.3 培养温度对产酶量的影响 分别选取不同温度:22、25、28、31、34 ℃，连续培养 5 d 后，测定其酶活，结果见图3，发酵温度与产酶量有一定的关系，温度过高或者过低都会影响酶的合成和分泌，其中，28℃条件下，产酶最高，为7.4 IU/mL。

图3 培养温度对产酶的影响

2.4 摇瓶转速对产酶量的影响 在不同摇床转速下（50、100、150、200、250 r/min）培养 5 d，测定其发酵液酶活，结果见图4。

图4 摇瓶转速对产酶的影响

2.5 初始pH对产酶量的影响 不同初始pH培养基（1、3、5、7、9）对产酶量的影响如图 5 所示。

图5 初始pH对产酶的影响

2.6 响应曲面试验结果

2.6.1 Box-Behnken设计试验结果 以初始pH（X1）、转速（X2）、温度（X3）为自变量，以产纤维素酶量为响应指标，采用 Box-Behnken方法设计响应面分析试验，试验设计及试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

2.6.2 响应面设计结果 根据表2的试验结果，利用Design Expert v8.0.5.b软件对试验数据进行分析，所得主要分析结果见表3。

二次模型中回归系数的显著性检验表明：因素A对产酶量影响效果的线性效应显著，因素B和C效应不显著；因素A2、B2、C2对结果的曲面效应显著，因素交互影响均不显著。对试验数据进行多次拟合回归，以纤维素酶量（Y）为因变量，初始pH（A）、转速（B）、温度（C）为自变量建立回归方程模型为：

表3 回归与方差分析结果

Y=+12.31+1.29A+0.88B+0.72C+0.41AB-0.068AC-0.022BC-2.23A2-3.47B2-1.89C2。

另外，由表3可知，试验因素对产酶量影响显著程度由大到小依次为初始pH＞转速＞温度；模型的回归F值为11.91，P=0.0018（P＜0.05为模型显著），表明该模型极显著；多元相关系数R2=0.9387，调整R2=0.9399，表明模型对试验实际情况拟合较好，失拟项差异不显著 （P=0.2277＞0.05），表示该方程试验拟合效果较好。

2.6.3 响应面图及等高线图 响应面和等高线结果见图6～8。在响应曲面图中，单因素影响效果与曲面陡峭相关，曲面越陡峭，影响越显著。等高线图与响应面图相对应，响应值越大曲线越接近中心。各因素交互作用与等高线形状相关，圆形则为不显著，椭圆为显著。

通过 Design Expert（v8.0.5.b）软件分析，粗糙脉孢菌产酶量的最佳培养条件为初始pH 7、转速159.24 r/min、培养温度27.9℃，此条件下菌体生物量的理论值为17.67 IU/mL。在该条件下进行3次试验验证，产酶量平均值为17.1 IU/mL，与预测值的误差仅为3.23%，表明该模型可靠性高，应用响应曲面法优化粗糙脉孢菌产纤维素酶的培养条件是可行的。

图6 初始pH与转速及其交互作用对产酶量影响的响应面和等高线图

图7 转速与温度及其交互作用对产酶量影响的响应面和等高线图

图8 初始pH与温度及其交互作用对产酶量影响的响应面和等高线图

3 讨论

农业废弃物主要包括农作物秸秆、畜禽粪便等，其主要组成成分是纤维素类物质。化工领域利用纤维素主要用高温、高压、强酸等方法处理，不仅成本高，而且污染环境（杨林丽等，2013）。

纤维素酶降解方法的优点是能源消耗低，是专一性很强的催化剂，但酶分子体积庞大，很难越过半纤维素和木质素的障碍，与纤维素紧密结合，所以进行该方法的反应时间长，且需在加热过程中进行振荡加热，使反应充分，一般要培养5～7 d，在培养菌丝的过程中容易有杂菌生长，需进行杂菌的处理。另外应用纤维素酶法处理秸秆纤维素条件温和，但酶活力一直达不到应用于实践的水平，而且价格昂贵。所以开发高产纤维素酶的菌种，利用酶固定化催化法是可行的办法（Rizzatti等，2001）。

响应面法是一项综合数学和统计学方法的优化技术。此方法可以对影响相关响应值的多个因素进行建模和分析，评估多个因素与响应值之间的关系，得到最优发酵培养基条件（Jatinder等，2006）。

响应面分析法在粗糙脉孢菌产纤维素酶培养条件的优化中取得了较为良好的效果，利用粗糙脉孢菌发酵产酶的研究还处在初期阶段，要实现其产酶潜力，还需要大量的研究，特别是针对深层液体发酵条件的菌株遗传改造工作和适合粗糙脉孢菌液体发酵条件优化值得深入研究（顾芮萌等，2012）。

4 结论

本试验以忻州地区腐败玉米秸杆、牛羊等食草动物粪便为原料，从中筛选出一株降解纤维素菌种，并确定其为粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）。通过对其液体发酵产纤维酶工艺进行优化，在最佳培养条件初始pH 7、转速159.24 r/min、培养温度27.9℃下，经试验验证，产酶量为17.1 IU/mL，提高了39.1%。

[1]毕于运，寇建平，土道龙.中国秸秆资源综合利用技术[M].北京：中国农业科学技术出版社，2008.

[2]冯炘，王丹，辛丽霞.粗糙脉孢菌产纤维素酶发酵条件研究[J].食品科学，2005，26 （1）：67 ～ 70.

[3]顾芮萌，李勇昊，田朝光.粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）纤维素酶液体发酵培养基的优化[J].中国生物工程杂志，2012，32（3）：76～82.

[4]李建波，宋欣，田敏，等.粗糙脉孢菌产黑色素条件优化及黑色素物理特性研究[J].山东大学学报（理学版），2004，39（4）：120 ～ 124.

[5]魏景超，真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979（第一版）.

[6]杨林丽，杜双田，许建周.纤维素降解菌筛选及混合菌种纤维素降解能力测定[P].西北农林科技大学，2013：1～5.

[7］张传富，顾文杰，彭科峰，等.微生物纤维素酶的研究现状[J].生物信息学，2007，5（1）：34 ～ 36.

[8]Banerjee G，Scott-Craig J，Walton J.Improving enzymes for biomass conversion:a basic research perspective[J].Bioenergy Res，2010，3：82 ～ 92.

[9]Fu D，Mazza G，Tamaki Y.Lignin Extraction from Straw by lonic liquids and Enzymatic Hydrolysis of the Cellulosic Residues[J].Agric Food Chem，2010，58：2915 ～ 2922.

[10]Jonathan M G，Tian C G，William T B，et al.Cellodextrin transport in Yeast for improved biofuel production[J].Science，2010，37（3）：128 ～ 132.

[11]Jatinder K，Chadha B S，Saini H S.Optimization of culture conditions for production of cellulases and xylanases by Scytalidium thermophilum using response surfacemethodology [J].World J Microb Bio，2006，22（2）：169 ～ 170.

[12]RizzattiAcS，Jorge J A，Terenzi H F，et al.Purificationand properties of a themostable extracellularβ-d-xylosidase produced by a thermotolerant spergillus phoenicis[J].J Ind Microbiol Biot，2001，26：156 ～ 160.

[13]Tian C G，William T B，Anthony T I，et al.Systems analysis of plantcellwalldegradation by the modelfilamentousfungus Neurospora crassa[J].Pnas，2009，330（6000）：84 ～ 86.