非实验期Jurkat细胞培养方法探讨

赵起超，方佳宁，马冠英，张晨昀，吕旦希，张若男，高梦炜，陈功星

（杭州师范大学医学院，浙江 杭州 310018）

影响细胞生长存活的因素很多，营养、pH值、温度是最基本的条件。细胞生长是一个持续的过程，而实验研究存在时间间隔。目前维持细胞生长常见的处理方法是每隔1天行换液传代[1]或者冻存。最近，细胞自噬引起关注。自噬是一种保守的细胞防御机制，在一定条件下细胞自噬能够维持细胞的存活[2]。引起细胞自噬的因素很多，包括血清、葡萄糖、温度和二氧化碳等。本文将探讨室温中维持Jurkat细胞非实验期的培养，并从细胞自噬方面寻求依据。

1 材料与方法

1.1材料 白血病T淋巴细胞株Jurkat细胞为培养细胞，小牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI1640培养基 （含青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL）、MTT购于Sigma公司；无菌塑料培养瓶为上海BD Falcon产品；封口膜为美国Parafilm公司产品。兔抗人LC3和Anti-rabbit IgG（H+L）（DyLight 800） 购于 Cell signaling 公司、βactin兔抗人多克隆抗体购于杭州华安生物公司；Western blot凝胶电泳试剂购于武汉谷歌生物技术公司；PVDF膜为Millipore公司产品；蛋白提取试剂盒购于碧云天生物技术公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 细胞株Jurkat培养于含10%小牛血清的RPMI1640细胞培养液中，半量换液传代，加入相近量的细胞培养剂，置于37℃培养箱中，待细胞呈对数生长时备用。

1.2.2温度对细胞生长的影响 Jurkat细胞2×105/mL接种6瓶，37℃培养箱放置1天，一分为二，分别于培养箱37℃培养和封口后室温培养，1天后各取1瓶，于96孔细胞培养板100μL/孔接种8孔，各2块，其余细胞回收；其中1块细胞孔加入10μL 5%的 MTT，混匀后置于 37℃培养箱中，4小时后1000rpm离心5分钟，然后加入100μL DMSO，振荡混匀溶解，570nm检测光密度OD值。另一块96孔板细胞加入100μL新鲜培养剂，37℃培养箱放置1天后加入20μL 5%的MTT，混匀后按前述一样操作检测光密度OD值。此后的细胞每隔2天重复上述操作。

1.2.3蛋白样品制备与western blot分析 按照蛋白提取试剂盒，根据细胞数量加入相应的提取试剂，依次制备蛋白电泳样品，然后上样到12%分离胶的垂直电泳变性胶上，经电泳、转膜、封闭后，根据marker位置裁剪actin膜和LC3膜，分别进入相应抗体4℃摇床过夜，然后TBST洗涤后一同进入Anti-rabbit IgG（H+L）（DyLight 800）反应液中作用2小时，洗涤后用Odyssey双红外荧光扫描仪保存图片观察结果。

1.3统计学处理 细胞活力以光密度OD值用（±s）表示，用SPSS软件进行独立样本均值t检验。

2 结果

2.1细胞活力MTT检测吸光度OD值 Jurkat细胞培养于37℃培养箱中，1天后换液传代，此时细胞呈对数生长，细胞活力达到最强，4天后细胞活力明显下降，6天后继续下降，各时间点之间差异有统计学意义（P＜0.01）；而室温培养 2天与4天细胞活力处于较高的位置，两者差异无统计学意义（P＞0.05），但6天细胞活力明显下降，与4天比较差异有统计学意义（P＜0.01）（图 1）。 此外，对上述室温培养各时间点同样细胞数量等倍新鲜培养剂传代培养，在37℃培养箱1天后，细胞活力均明显升高，OD值接近被传代细胞的2倍，结果显示，2天和4天传代培养后两组细胞的增值MTT值之间差异无统计学意义（P＞0.05），与6天传代培养相比差异有统计学意义（P＜0.01）（图 2）。

2.2细胞自噬LC3蛋白分子表达Western blot检测 Odyssey双红外荧光扫描仪同时分析了actin和LC3蛋白分子的表达，以actin为参照，呈现样本量接近，LC3均出现了16 KD和14 KD两条带，在相同温度内的不同培养时间点（2天和4天）之间未见差异，但在相同培养时间点的不同培养温度（37℃和室温）之间存在明显差异，室温培养细胞均出现了14 KD的量度增加，在图中体现宽度更大，而16 KD相对37℃培养细胞量度减少，可见条带要细小一些（图3）。

图1 Jurkat细胞在两种温度培养条件下的MTT检测吸光度OD值

图2 Jurkat细胞在室温培养和传代培养1天后MTT检测吸光度OD值

图3 不同温度培养的Jurkat细胞Western blot检测结果

3 讨论

细胞培养技术是生物医学研究中广泛使用的实验手段。细胞是不断生长、脆弱的简单生命体，需要时刻关注、维护，费时费力。细胞冻存可以在保存细胞生命的同时，暂时阻断生长，但冻存后细胞复苏时间较长；为满足实验条件需要保持细胞呈指数生长，这就增加了遗传稳定性问题，非实验期无意义的传代会导致子代细胞很快达到较大传代次数，其细胞特性、对药物的反应、病原体易感性、基因结构和表达可发生变化，直接影响实验结果准确度[3]。前期实验利用低温延缓Jurkat细胞传代次数，20天内不传代细胞存活率仍然维持80%以上[4]，但该技术倾向于细胞保存，随后恢复细胞对数期生长耗时较长。本实验中室温培养条件下Jurkat细胞4天时的细胞活力仍与2天时相拟（P＞0.05），至 6 天时出现明显的差异（P＜0.01），此结果与本研究前期用台盼兰分析Jurkat细胞存活的研究报道[4]一致。而37℃培养4天时细胞活力已明显不如2天（P＜0.01），表明Jurkat细胞在37℃培养箱环境中不能维持4天以上，须进行换液或传代处理。本实验中Jurkat细胞室温培养时，细胞前期处理同文献报道[5]，培养过夜后封口，细胞仍然保持了一定的活力，这与报道文献[5]相一致。而本研究室温各培养点传代37℃培养1天后，细胞活力均达到了传代前的2倍左右，且室温2天与4天传代37℃培养后细胞活力未见差异（P＞0.05），表现出了细胞对数期生长的特点。因此，Jurkat细胞室温培养4天后再行传代室温培养，可替代37℃培养，说明Jurkat细胞传代时间延长了一倍。对这两种温度条件下的细胞再行细胞自噬分析，观察细胞2天和4天后，发现室温培养Jurkat细胞自噬增强，相关研究表明，细胞经亚低温处理后，恢复到正常体温，细胞发生了自噬、凋亡、氧化损伤等一系列变化[6]，这也表明了低温诱导细胞自噬在一定程度上具有细胞保护作用[2]。亚低温在临床上已经运用于对重要器官缺血缺氧的保护，重型创伤性颅脑损伤采用亚低温脑保护治疗，可有效降低患者颅内压，减少出血量[7]。通过本研究表明室温条件下4天内可以维持非实验期细胞正常培养，减少无意义的细胞传代导致的人力物力浪费和细胞生物遗传稳定性的问题。

[1] DL斯佩克特，RD戈德曼.细胞实验指南.黄培堂，译.天津:科学技术出版社，2001:10

[2] 向波，易梅，李小玲，等.细胞自噬在肿瘤发生发展中的作用.生物化学与生物物理进展，2012，39（3）:241

[3] 黄小琴，李彦涵，陶玉芬，等.KMB-17细胞株的遗传稳定性.中国生物制品学杂志，2009，22（2）:150

[4] 董大鹏，孙佳，刘娜，等.非冻存低温下维持悬浮培养细胞.健康研究，2011，31（6）:410

[5] 陈丽洁，王犇，赵起超，等.二甲基亚砜直接加入培养中Jurkat细胞继续冻存.华夏医学，2016，29（3）:10

[6] Neutelings T，Lambert CA，Nusgens BV，et al.Effects of mild cold shock （25℃） followed by warming up at 37℃ on the cellular stress response.PLoS One，2013，8（7）:1

[7] 张志伟，李保林，杨彩浮，等.亚低温脑保护应用于重型创伤性颅脑损伤治疗的临床价值.中国公共卫生，2015，31（2）:247