甲基异噻唑啉酮对斑马鱼胚胎的急性毒性和机制研究

吕鹏，吴巍，刘丽丽，张家禹，许雷，闫艳春

中国农业科学院研究生院，生化与分子生物学实验室，北京 100081

近年来，我国从欧洲引进了一种新型杀菌剂甲基异噻唑啉酮(methylisothiazolinone，MIT)，是异噻唑啉酮类衍生物，和其他同类衍生物相比毒性较弱[1-2]。MIT是一种高效、广谱、药效持久且相对安全的杀菌剂，广泛应用于工业生产，如涂料、胶水、造纸业、橡胶、感光胶片及洗涤用品等[2-5]。优点是有效用量少，极易混合在各类配方中，能很好地抑制微生物的生长，因此MIT被广泛添加进化妆品和个人护理品制剂中，以延长保存期[1-3, 7-9]。生产的工业废水、生活污水中大量MIT随地下水循环系统等途径进入环境水体中，已有研究者在污水口和河流中检测到了相当量的MIT存在[8, 10-11]。尽管也有报道显示MIT在水体中含量为ng·L-1级，且在自然环境中半衰期很短[11]，然而持续排放入水体而残留下来的MIT是否危害水生生物的生存，影响水生生态的健康，需要进一步研究。

文献报道，MIT对黑斑蛙胚胎的96 h-LC50和半数致畸浓度(96 h-TC50)分别为5.30 mg·L-1和2.36 mg·L-1，最小生长抑制浓度(MCIG)为2.59 mg·L-1，对蝌蚪的96 h-LC50为7.58 mg·L-1 [12]，对草鱼肝脏肾脏器官的细胞，在48 h后，温度分别为15 ℃和25 ℃下的LC50范围为0.53 mg·L-1和0.41 mg·L-1[13]，对卤虫无节幼体96 h-LC50为10.4 mg·L-1 [14]。还有研究表明MIT对小鼠表皮和呼吸系统的免疫应答有强烈刺激作用，接触2.5%的MIT处理液就能引起小鼠皮肤过敏反应和刺激性皮肤炎[15-16]。随着异噻唑啉酮类其他衍生物控制力度的加大，使异噻唑啉酮类物质的危害淡出了人们的视线，且MIT对鱼类毒性数据还很欠缺，所以对于水体中残留的MIT对鱼类的影响评价不足。但是MIT作为目前最广泛使用的异噻唑啉酮类物质，其在水中残留和对鱼类的威胁也应该引起重视[7,9,15]。

斑马鱼作为毒理学模式动物，具有遗传背景清晰，体型小，产卵量大，胚胎发育迅速，早期透明，可清晰看到发育各阶段，便于观察和显微操作等特点。斑马鱼胚胎也广泛应用于急性毒性实验中，评价各种化学物质的毒性作用[17-20]。本研究以斑马鱼胚胎为模型，根据OECD实验标准(OECD Guidelines for the Testing of Chemicals)[21]，进行急性毒性实验，评价MIT对斑马鱼胚胎的毒性效应，为MIT的环境污染管控提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

AB品系斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心(China Zebrafish Resource Center, CZRC)。

仪器设备：斑马鱼养殖系统(爱生科技发展有限公司，北京)；雷磁PHS-3D型pH计(精密科学仪器有限公司，上海)；电导度测试仪(哈纳公司，意大利)；BPC-250 F型生化培养箱(一恒科学仪器有限公司，上海)；荧光显微镜X83(奥林巴斯，日本)；Heal Force超纯水系统(力康集团，香港)；一次性吸管和培养皿(康健华医疗用品有限公司，江苏)；塑料六孔细胞培养板(耐思生物科技有限公司，无锡)；精密型pH试纸(sigma公司，美国)。

试剂药品：甲基异噻唑啉酮(MIT, CAS NO: 2682-20-4; 99%，百灵威，中国)；吖啶橙(acridine orange, CAS: 10127-02-3，索莱宝，中国)；霉链蛋白酶(protease，CAS: 37259-58-8, Qiagen公司，德国)；三卡因甲磺酸盐麻醉剂(tricaine methanesulfonate, TMS, CAS: 886-86-2, Sigma公司，美国)；氯化钠、碳酸氢钠等化学药品均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验生物

斑马鱼的养殖方法：实验用AB品系斑马鱼在自动水循环养殖系统中进行饲养，系统自动维持养鱼水的电导度在500～550 μS·cm-1之间，pH 为7.0～7.5，溶解氧>6.0 mg·L-1，水温控制在(28±0.5) ℃，饲养环境光周期为光:暗=14 h:10 h。每天喂食新鲜丰年虫幼虫2～3次，幼虫由丰年虫卵(Aquamaster公司，中国台湾)孵化得到。孵化时，将丰年虫卵放于25 g·L-1氯化钠溶液中，水温(28±0.5) ℃，持续通气，连续光照32 h即可孵化，收集幼虫后去除杂质并用清水洗去过多盐分，可短期存放于4 ℃冰箱，或于-20 ℃下冻存[22]。

斑马鱼胚胎的收集方法：于前一天晚上将成年种鱼按照雌雄比例2:2装入交配盒中，并用隔板将雌雄鱼分开。第2天早上光照开始时(10 h后)将隔板抽出，待雌雄鱼追尾交配30 min后收集发育时期一致的健康胚胎[18, 24-25]。将收集到的胚胎混合均匀，换干净的养鱼水于培养皿中，作实验材料。

1.3 实验方法

1.3.1 斑马鱼胚胎毒性实验

为保证对照组胚胎死亡率小于5%，排除未受精及异常胚胎对毒性评价的干扰，本实验选择在受精后3 h (3 hours post-fertilization，3 hpf)开始暴露染毒。收集到胚胎3 h后，去除异常和死胚，并在倒置显微镜下挑出正常分裂的胚胎。MIT浓度范围根据预实验结果设置，将提前配制的1.0 g·L-1MIT储备液用养鱼水依次稀释到1.52、3.71、5.43、7.12、9.48 mg·L-1，包含1个对照组，各制备500 mL处理液(避光保存)。每个处理组包含3个生物学重复，20个胚胎为一个重复。实验在6孔板中进行，每孔加入10个健康的3 hpf胚胎，尽量去除水分之后再分别加入不同浓度的处理液10 mL，对照组加入等体积养鱼水。采用半静态方式进行暴露处理，将培养皿置于恒温生化培养箱中，暴露总时间为96 h(即从3 hpf～99 hpf)，培养箱孵化温度为(28±0.5) ℃，处理液pH维持在7.0，电导率约510 μs·cm-1，溶氧量>6 mg·L-1，保持胚胎处理过程中光:暗=14 h:10 h。本实验处理条件比较稳定，预实验中对处理液监测和高效液相色谱分析结果显示，换水前后处理液性质和MIT浓度保持恒定，所以采用换水式对斑马鱼胚胎进行毒性实验[18-19, 24]，即每24小时更换一次处理液，及时挑出死亡的胚胎。每24小时对斑马鱼胚胎进行一次镜检观察，测量不同时期的各项生理指标和死亡、畸形等数据，进行记录。

1.3.2 细胞凋亡吖啶橙染色

吖啶橙染色用于检测细胞凋亡情况，实验流程参照文献[20, 25]。

具体方法为：选取半致死浓度1/10左右的浓度作为处理起始浓度，依次设置MIT浓度为0.5 mg·L-1、0.75 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1。处理72 h后，收集存活胚胎，用养鱼水清洗2～3次后，对没脱膜的胚胎使用5 mg·mL-1链蛋白酶在25 ℃下脱膜2 min，再用养鱼水清洗2～3次，显微镜下选出存活、完整的胚胎放于培养皿中，以备染色。

染色方法：将提前配好的吖啶橙1 g·L-1储备液用养鱼水稀释到2 mg·L-1，将脱膜后的胚胎转移到2 mg·L-1的吖啶橙溶液中，避光染色30～60 min，定时观察，当胚胎出现死亡时可以终止染色。染色终止后用养鱼水润洗胚胎2～3次。清洗完毕后，使用0.1 g·L-1Tricaine麻醉剂处理5～10 min。待胚胎麻醉，在荧光显微镜下观察并拍照，所有照片拍摄条件均相同，观察带有黄绿色荧光标记的凋亡细胞。

1.3.3 统计分析

在急性毒性实验过程中，每24小时记录一次胚胎死亡数，24 h时记录胚胎自主抽动次数，48 h后统计孵化胚胎数，96 h后统计存活的幼鱼数量，以及存活胚胎的畸形数，并在显微镜下观察畸形状况，测量正常幼鱼72 h时的心率、96 h体长等生理特征，并分析胚胎-幼鱼运动、反应等行为学特征。

毒理学数据统计：斑马鱼胚胎的孵化从48 hpf开始，本实验统计处理后48 h(51 hpf)胚胎的孵化率。并以处理浓度为自变量x，胚胎孵化率为因变量y，使用SPSS 22软件，用单因素方差分析(one-way ANOVA)法分析处理组和对照组之间孵化率差异的显著性。采用Origin Pro 15软件处理96 h死亡率和畸形率数据，由logistic非线性回归分析，得到“剂量-效应”曲线方程，计算MIT的96 h-LC50和96 h-TC50及95%的置信区间。

形态和生理特征分析：选取72 h存活的幼鱼，在体视显微镜下统计胚胎心率，处理到96 h后观察幼鱼运动行为和应激反应情况，用0.1 g·L-1Tricaine麻醉剂处理5～10 min，每个处理组测量30个胚胎的体长，取平均值，使用SPSS 22中的T检验分析其最小生长抑制浓度和最低毒性效应剂量。

吖啶橙染色分析：选取不同角度，将处理组图片与对照组进行比对，找到凋亡细胞差异区域，排除本底荧光的干扰，分析处理组中凋亡细胞富集的范围，从而判断MIT的毒性作用区域。

2 结果(Results)

2.1 斑马鱼胚胎毒性实验

2.1.1 MIT对胚胎孵化率的影响

MIT处理液暴露48 h时，对斑马鱼胚胎的孵化率进行了统计。研究发现较低浓度的MIT对胚胎孵化就有抑制作用，在梯度浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg·L-1)的MIT处理下，孵化率随浓度增大而降低。对照组孵化率为31.96%，MIT浓度大于1.0 mg·L-1时，孵化率显著下降，当浓度大于4.0 mg·L-1后，孵化率低于15%，使用SPSS 22软件进行单因素方差分析((one-way ANOVA)，得到不同处理浓度下孵化率之间差异显著性(图1所示)。

图1 甲基异噻唑啉酮(MIT)处理48 h后对胚胎孵化率的影响注：A. MIT不同浓度处理组胚胎孵化率，数据表示为平均值±SE(n = 3, 每个生物重复20个胚胎)，差异显著性用星号表示， *P<0.05， ** P<0.01, *** P<0.001；B. 孵化胚胎占存活胚胎的比例。Fig. 1 Effects of methylisothiazolinone (MIT) on hatching rate after 48 h exposure Note: A. Hatching rate at different concentration of MIT， values are presented as mean ± SEM (n = 3, 20 embryos in each replicate); * P < 0.05, ** P < 0.01; *** P < 0.001; B. Percentage of hatched embryos in survival embryos.

图2 MIT在72 h和96 h时对斑马鱼胚胎的致死率统计注：A. 致死率随浓度和处理时间递增，B. 96 h致死率logistic拟合，R2为0.9988(3个平行试验，n=3)。Fig. 2 Mortality of zebrafish embryos exposed to MIT after 72 h and 96 hNote: A. Mortality increased with time and concentration increasing; B. logistic nonlinear fitting of 96 h mortality, R2=0.9988 (three parallel tests, n=3).

图3 MIT的致畸效应 注：A为96 h发育正常的幼鱼; B为体轴向内弯曲(1)和尾部畸形(2); C为体轴向外弯曲(1)；D为心包囊肿和卵黄囊水肿；E为尾部发育不良；F为发育迟缓胚胎的畸形胚胎。Fig. 3 Teratogenesis effect of MITNote: A. normal control; B. body axon incurve (1) and tail dysmorphia (2); C. body axon outcurve (1); D. pericardial edema and yolk edema; E. tail dysontogenesis; F. embryos developmental retardation.

2.1.2 MIT对胚胎死亡率的影响

根据预实验结果，确定急性毒性实验MIT处理组浓度范围为1.52～9.48 mg·L-1。48 h前未孵化胚胎的死亡率比较低，到72 h后处理组胚胎开始出现死亡，且随处理浓度递增，到96 h后，9.48 mg·L-1浓度下幼鱼全部死亡。对死亡率进行logistic非线性拟合，呈S型“效应-剂量”曲线，根据拟合方程得到96 h-LC50为6.15 mg·L-1，95%置信区间为(4.97, 7.34)，对鱼类高毒，其安全浓度采用通用算法：96 h-LC50×0.01=0.06 mg·L-1(图2所示)。

2.1.3 MIT对胚胎畸形率的影响

MIT处理96 h后，使用奥林巴斯IX 83显微镜观察斑马鱼形态以及运动特征，统计孵出幼鱼中畸形个体数。观察发现MIT引起3种主要的畸形形态：体轴弯曲(包含尾部弯曲)、心包水肿和卵黄囊水肿(图3所示)，3种畸形中，体轴弯曲的个体占大多数。畸形率随MIT处理浓度梯度提高而升高，在较低浓度时就有明显的致畸效应，1.0 mg·L-1的浓度下畸形率就达到了18.4%，可见MIT对胚胎发育有很大影响。统计得到96 h畸形率后，通过Origin Pro 15进行非线性拟合分析。得到96 h-TC50为3.89 mg·L-1，95%置信区间为(2.96, 4.82)(图4所示)。

2.1.4 MIT对斑马鱼胚胎生理特性的影响

经显微镜观察发现，MIT对斑马鱼生长具有抑制作用，主要体现在幼鱼心率的降低和体长缩短。在MIT梯度浓度暴露下，72 h时不同处理组斑马鱼幼鱼心率随处理浓度提高而降低，对照组中幼鱼心脏搏动有力，平均心房率为(175±4) beats·min-1，处理浓度达到1.52 mg·L-1时，心率与对照组相比显著下降(表3所示)。测量96 h幼鱼体长数据显示，浓度大于2.31 mg·L-1的处理组中胚幼鱼长与对照组存在显著差异，显著性分析可判断MIT对斑马鱼幼鱼生长的最小抑制浓度(MCIG)为2.31 mg·L-1(表4所示)。

图4 MIT对斑马鱼幼鱼96 h的致畸率以及96 h致畸率logistic拟合注：A为致畸率随浓度升高显著增大，B为96 h时3个平行实验拟合，R2为0.9933。Fig. 4 Zebrafish embryo deformity exposed to MIT after 96 h and its logistic nonlinear fittingNote: A, Increase of deformity with the increase of MIT concentration; B, Three parallel experiments fitting, R2=0.9933.

表4 MIT 96 h暴露对斑马鱼幼鱼体长的影响Table 4 Effects of MIT on the body length of zebrafish larvae after 96 h exposure

注：*表示处理组与对照组相比存在显著差异(P<0.05)。

Note：*Indicates significant difference between exposed groups and the control group (P< 0.05)．

图5 MIT暴露下细胞凋亡分析注：在MIT暴露72 h后，对斑马鱼胚胎进行吖啶橙染色；(A)和(B)为对照组和0.25 mg·L-1处理组，没有凋亡细胞；(C)和(D)为1.0 mg·L-1处理组，在尾部有大量凋亡细胞存在；(E)和(F)为1.0 mg·L-1的处理组，观察到有大量凋亡细胞存在于脑部；(G)和(H)为2.0 mg·L-1处理组，有大量凋亡细胞分布在脑部和鳃部。图中用白色箭头标记凋亡细胞分布。Fig. 5 MIT-induced apoptosis analysis Note: After exposure to MIT for 72 h, the zebrafish embryos were stained with acridine orange (AO); (A) and (B), No apoptotic cells were observed in the control and 0.25 mg·L-1 MIT treated groups; (C) and (D), A large number of apoptotic cells were observed in tail in the 1.0 mg·L-1 MIT treated groups; (E) and (F), A small area of apoptotic cells were observed in the brain in the 1.0 mg·L-1 MIT treated groups; (G) and (H), In 2.0 mg·L-1 groups, a lot of apoptotic cells were observed in gill and brain. Apoptotic cells were indicated by white arrowheads.

2.2 细胞凋亡AO染色

AO染色检测MIT暴露下胚胎细胞凋亡情况，MIT梯度暴露浓度为0.25、0.75、1.0、2.0 mg·L-1，72 h的暴露胚胎脱膜后染色，在荧光显微镜下观察发现，对照组和0.25 mg·L-1的处理组中没有明显的凋亡细胞群体，当处理浓度达到1.0和2.0 mg·L-1后，能够在高倍镜下观察到凋亡细胞，主要出现在胚胎脑部和尾部(图5所示)。

3 讨论(Discussion)

由于个人护理产品、日用品和涂料在生活中无处不在，而且近年来一些由这些物品导致的过敏、疾病，使人们开始关注其中防腐剂的危害。甲基异噻唑啉酮是其中使用最广泛的防腐剂和抗菌剂，随着国际社会对MIT毒性的逐渐认识，对其毒性评价也开始逐渐开展。

本文首次研究了MIT对斑马鱼胚胎的急性毒性，根据高效液相色谱分析，在实验条件下，72 h内处理液中MIT浓度和性质都能保持稳定[6]。MIT对胚胎孵化有很强的抑制作用，当浓度大于等于1.0 mg·L-1时，就能显著抑制胚胎孵化，不能顺利孵化的胚胎在96 h后全部死亡，药物可能对胚胎早期发育相关基因或对胚胎早期生理代谢有影响，导致胚胎发育后期孵化酶分泌和活性降低而不能分解卵壳，暴露可能干扰了孵化酶的结构和功能，具体的抑制机理有待于进一步研究[26-27]。暴露浓度为1.52 mg·L-1时，96 h后幼鱼的死亡率明显上升，当浓度达到9.48 mg·L-1时96 h幼鱼全部死亡，得到了MIT对斑马鱼胚胎96 h的半致死浓度为6.15 mg·L-1，这对水生生物而言是高毒。暴露浓度为0.5 mg·L-1时畸形胚胎数量相比对照组显著增多，暴露的胚胎在96 h的半致畸浓度为3.89 mg·L-1。同时，统计MIT暴露96 h的幼鱼体长数据后，得到了最小生长抑制浓度为2.31 mg·L-1，值得注意的是，在2.31 mg·L-1的浓度下，多数胚胎都已产生畸形。与骨骼发育相关的畸形，如体轴弯曲占畸形比率较大，而且幼鱼体长显著变化。一方面，MIT暴露干扰了Wnt、Notch和Tgf-8等信号通路，影响胚胎靶器官的发育；另一方面可能是通过干扰发育重要基因的表达调控，如nbtps、nkx2.5和tbxl6等，进而影响随后的胚胎靶器官的发育，从而导致胚胎畸形发育[19,24]。在对胚胎生理特性和行为观察中发现，暴露于1.52 mg·L-1以上浓度的MIT就能使胚胎心率显著降低，心率降低在某种程度上也体现了MIT的心脏毒性[28-29]。关于斑马鱼神经系统发育的研究表明，24 h后胚胎神经系统已经基本发育成熟，自主抽动次数小于等于1次[30-31]，实验观察到MIT浓度大于1.52 mg·L-1的暴露组，24 h胚胎每分钟自主抽动次数大于1次，表明神经系统的发育受到影响。进一步观察72 h和96 h幼鱼的行为，发现MIT浓度大于1.52 mg·L-1的暴露组胚胎自主活动能力下降，且触碰反应迟钝，这表明它们的神经系统发育受到了影响[31-34]。综上所述，实验中大量数据和现象都表明，MIT对斑马鱼胚胎产生了比较显著的毒性作用，包括孵化抑制、致畸性、发育抑制、心脏毒性、神经毒性，充分说明MIT对水生物的毒害作用不容忽视，同时也为毒性机理的研究提供了依据。

本研究显示MIT对斑马鱼胚胎具有高毒，由此看来MIT对水生生物的毒性已经不容忽视。MIT主要通过污水排放系统进入环境中，广泛分布于地表水中，环境监测一般水体中MIT含量通常在ng·L-1，而在污水排放口附近的河流处含量为μg·L-1[8,11]。MIT在环境中的降解主要受光照、温度、pH、金属离子、溶液介质等因素的影响，有研究表明，光照、碱性、含铁离子和强亲核试剂，如硫化物的溶液能显著加速异噻唑啉酮的光降解[35]。这些都导致了MIT的环境浓度远低于实验中的毒性效应浓度，但在局部水环境中也会有过量MIT，且长期暴露于MIT污染的环境中，也可能在生物体中富集，且根据安全系数分析，长期暴露于低浓度MIT下也会对鱼类产生不良影响[36]。

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