人端粒酶反转录酶过表达抑制低氧/复氧大鼠心肌细胞的凋亡

王平善，刘 阳

(桂林医学院附属医院 心外科， 广西 桂林 541000)

端粒酶(telomerase，TE)是由端粒酶RNA和蛋白质所构成的核糖核蛋白复合物，它能以自身RNA 为模板不断合成端粒DNA 并添加到染色体末端，从而阻止端粒的不断缩短，进而稳定染色体的长度和结构，避免细胞因端粒丢失导致的死亡。在端粒酶的组成中，人端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)是TE的催化亚基，是决定其活性的关键基因， 过表达TERT基因可以发挥端粒对DNA的保护和修复功能[1- 2]。近年有报道，TERT 基因在生物体中不仅是对端粒的保护作用，而且还具有许多非端粒酶依赖性效应，如抗应激、调控线粒体功能、能量代谢、细胞Ca2+分布和促进细胞存活及抗细胞凋亡等[3- 6]。本研究通过构建携带端粒酶反转录酶基因的重组腺病毒载体，探讨端粒酶与细胞增殖和凋亡的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料:Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(上海前尘生物科技有限公司)；RNA提取试剂Trizol(TaKaRa公司)；RT-PCR试剂(DBI公司)；自转录试剂盒(DBI公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(PierceTM BCA Protein Assay Kit)，Rat TE ELISA Kit(E-EL-R0947c)，DEPC(Sigma公司)；RNasin(Promega公司)。

1.1.2 细胞及病毒载体:出生3d的幼鼠心肌细胞(rat cardiac myocytes，RCM)(北京裕恒丰科技有限公司)；TERT siRNA(m)慢病毒载体Lenti-KDTMmiRNA-EGFP和TERT过表达慢病毒载体Lenti-OETMcDNA-EGFP(上海吉凯基因化学有限公司设计构建)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及处理：参考文献中建立的心肌细胞低氧/复氧(hypoxia/reoxigenation，Hypo/Ro)模型方法[7]，将心肌细胞培养在含体积分数为10%小牛血清的改良伊戈尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)，并置于饱和湿度、95%空气和5% CO2、37 ℃恒温密闭式培养箱中培养，每2天更换1次培养液。实验时取对数增殖期细胞，并分为对照组和Hypo/Ro组2组， Hypo/Ro组培养液采用不含血清和不含糖的DMEM培养基培养，并置于37 ℃密闭的低氧培养箱中(95% N2和5% CO2)，10 h后置换新鲜培养基，置于含95%空气和5% CO2的密闭培养箱中继续培养，2 h后收集细胞。对照组置于37 ℃常氧培养，12 h后收集细胞。

1.2.2 Real-time PCR检测TERT、CytC和P21的miRNA表达：Real-time PCR扩增的反应体系为：Bestar® SybrGreen qPCRmasterMix 10 μL；PCR正向引物(10 μmol/L) 0.5 μL；PCR反向引物(10 μmol/L)0.5 μL；cDNA 2 μL；ddH2O 7 μL；Total 20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，40个循环。熔解曲线分析：温度65 ℃～95 ℃。每个样重复3次。实验按照2-△△Ct方法计算基因相对表达量值。引物设计： TERT：正义链：5′-CCTTGCCA TGTTCCTGTTCTG-3′；反义链：5′-GTTGCCTGATTCC AATGCTCT-3′； CytC：正义链：5′-CAGGATTTTCTTA CACGGATGC-3′；反义链：5′-TGCCTGGGATGTATT TCTTCG-3′；P21：正义链：5′-GAACAGTAGACACG AAACAGGC-3′；反义链：5′-TATAGAAGGCATCGT CAACACC-3′；GAPDH：正义链：5′-CCTCGTCTCA TAGACAAGATGGT-3′；反义链：5′-GGGTAGAGT CATACTGGAACATG-3′；实验按照2-△△Ct方法处理数据。

1.2.3 病毒载体的转染：用构建好的病毒载体对接种24 h的心肌细胞进行转染，并设置普通对照组(未转染)，过表达空白组(转染不携带TERT基因病毒载体)，TERT过表达组(转染携带TERT基因病毒载体)，沉默表达空白组(转染不携带TERT siRNA病毒载体)，TERT沉默表达组(转染携带TERT siRNA病毒载体)，共5组。每个细胞转染15～20个病毒。使用10% FBS的低糖DMEM培养基培养，培养3～5 h后按上述方法进行Hypo/Ro处理。提取蛋白并行缺口末端标记法染色(Tunnel染色)。

1.2.4 Western blot检测转染后TERT、CytC和P21蛋白浓度：常规方法提取RCM总蛋白，行SDS-PAGE电泳及转膜。一抗为稀释后的TERT(稀释比 1∶400)、CytC(稀释比 1∶1 000)、P21(稀释比1∶1 000)抗体及GAPDH抗体，二抗为HRP羊抗兔抗IgG(稀释比1∶5 000)。BCA试剂显影后用Image-Pro Plus 6.0凝胶图象处理系统分析条带吸光度值，用GAPDH条带吸光度值进行校正，得出各条带的相对吸光度值。

1.2.5 流式细胞计量术检测Hypo/Ro诱导的心肌细胞凋亡：取对数增殖期的RCM悬液6孔板中(5×104/孔)，在37 ℃ 5% CO2孵箱中培养，48 h后用胰蛋白酶将细胞从6孔板中消化，2 000 r/min离心5 min，用4 ℃预冷的l×磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，100 μL 1×结合缓冲液重悬细胞，再加入10 μL Annexin V-APC混匀后，避光反应，冰上孵育10 min后，每管加入380 μL 1×结合缓冲液后再加入10 μL 7-AAD染色液，1 h内进行流式细胞仪检测。

1.2.6 ELISA测定转染后心肌细胞TE水平：参照伊莱瑞特生物科技有限公司Rat TE ELISA Kit试剂盒说明书进行操作。测量TE在450 nm波长处吸光度值，并根据标准曲线图查出相应的浓度；再乘以稀释倍数，即为TE的实际浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TERT、P21及CytC表达的变化

Hypo/Ro组TERT及P21的表达明显低于对照组(P<0.05)，Hypo/Ro组CytC的表达高于对照组(P<0.05)(表1)。

表1 低氧复氧损伤对心肌细胞相关基因表达量的影响

*P<0.05 compared with control group.

2.2 病毒转染效率

TERT和P21蛋白的表达在TERT过表达组最高，TERT沉默表达组TERT及P21的表达明显低于其余各组(P<0.05)。CytC的表达在TERT沉默表达组最高，在TERT过表达组最低(P<0.05)(表2，图1)。

2.3 TERT表达的变化对缺血再灌注心肌细胞的影响

2.3.1 TERT表达的变化对心肌细胞Hypo/Ro诱导的细胞凋亡的影响。正常活细胞 Annexin V-APC及7-ADD均低染，分布在流式细胞分析图的左下区；早期凋亡细胞Annexin V-APC高染7-ADD低染，分布在图的右下区，晚期凋亡或死亡细胞Annexin V-APC及7-ADD均高染， 分布在图的右上区。

表2 转染后各组心肌细胞相关蛋白的表达

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with overexpression control group;#P<0.05 compared with silent control group.

A.TERT overexpression group; B.overexpression control group; C.silent expression control group; D.TERT silent expression group; E.control group图1 转染后心肌细胞TERT、CytC和P21蛋白的表达Fig 1 Expression of TERT, CytC and P21 proteins in cardiomyocytes after transfection

早期凋亡细胞百分数和晚期凋亡细胞百分数之和称为总凋亡率。Hypo/Ro组与对照组相比心肌细胞早期凋亡率增加，总凋亡率亦增加(P<0.05)。对比转染后心肌细胞，TERT过表达组心肌细胞的凋亡率明显低于TERT沉默表达组，同时TERT过表达组心肌细胞的凋亡率较I/R组明显降低，TERT沉默表达组的凋亡率明显高于Hypo/Ro组(P<0.05)(图2)。

2.3.2 TERT表达的变化对端粒酶活性的影响。TE蛋白浓度在TERT过表达组最高，在TERT沉默表达组最低(P<0.05)(图3)。

A.control group; B.Hypo/Ro group; C.TERT overexpression group; D.TERT silent expression group;*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with Hypo/Ro group

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)是心脏外科手术后最常见的并发症之一，其与氧自由基产生、钙超载、炎性反应因子和炎性反应细胞聚集等因素有关，其实质是诱导心肌细胞的凋亡。端粒是真核细胞染色体末端的特有结构, 随着细胞的分裂不断缩短。端粒有一段特殊DNA序列能使染色体不被降解，而端粒酶能稳定端粒的长度和结构，从而保护染色体，抑制细胞凋亡[8- 9]。可见，通过控制端粒的功能干预缺血再灌注损伤的过程具有较高的可行性。

TERT是端粒酶活性的主要决定因素，同时具有抑制细胞凋亡的作用。转染外源性TERT可以促进细胞TERT的表达，抑制细胞凋亡。此外TERT还具有DNA修复功能[10- 11]，能通过调节DNA修复蛋白的表达，促进DNA修复、稳定染色体结构而抑制细胞凋亡。此外，TERT还有可能通过调节细胞增增殖[12]来抑制细胞凋亡。

*P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with overexpression control group; #P<0.05 compared with silent control group图3 转染后心肌细胞TE蛋白的表达Fig 3 Expression of TE protein in cardiomyocytes

本研究中，外源性TERT的转染促进了体外培养的心肌细胞TERT的表达，增加端粒酶的活性，保护心肌细胞。同时，过表达的TERT可促进细胞内P21的表达并抑制CytC的表达。 P21基因为细胞周期的负性调控因子, 过表达所产生的大量P21蛋白可使细胞周期停于G1期、G2期或S期，抑制DNA 复制，使受损的细胞得到充分修复，减少凋亡的发生[13]。CytC是线粒体起源的细胞凋亡因子，在Hypo/Ro损伤中同样发挥重要作用，不仅可直接介导细胞凋亡，而且还能通过干扰电子的传输、阻断能量的合成、促进氧自由基的产生等方式间接参与细胞凋亡[14]。本研究中P21及CytC基因表达的变化，提示它们也参与了TERT对心肌细胞的保护作用，其具体作用机制尚待进一步研究。

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