小檗碱改善动脉粥样硬化小鼠的血管炎性反应和钙化

李晓明，王青竹，石 婧，鞠 瑞，朱 蕾，李 娟，郭 磊，叶菜英

(中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 药理系，北京 100005)

随着中国生活水平的提高，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)性疾病已跃居于人口死亡的主要原因之列。动脉粥样硬化的发病机制很复杂，目前关于动脉粥样硬化的病因较为一致的看法是因脂质代谢紊乱、炎性细胞浸润、氧化应激、血管内皮细胞损伤和平滑肌细胞激活等[1]，这些机制都不是独立发挥作用的，而是相互渗透，因果循环的，最终导致斑块的破裂，血栓形成，造成严重心脑血管疾病。

小檗碱(berberine，BBR)是一种从黄连中提取出来的中药成分，一直以来广泛用于胃肠炎和细菌性痢疾，近年来发现它是一种新型的降低胆固醇的药物，它的作用机制虽然目前没有解释的非常清晰，但是与常用于治疗动脉粥样硬化的他汀类药物不同。近年来对于小檗碱的降脂机制，最多的观点是认为小檗碱可以上调LDL受体的表达[2]。对于它缓解动脉粥样硬化的其他作用机制，尚未阐释的十分明了。本文将从调节血管内皮炎性反应和影响血管钙化的角度对BBR的作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：48只SPF级Apo-/-E雄性小鼠，6 ～8周，体质量18 ～22 g[北京华阜康生物科技股份有限公司，SCXK(京)2014- 0004]。

1.1.2 实验细胞系：人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)和兔主动脉平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMCs)系(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)。

1.1.3 药品及试剂：小檗碱(BBR)(Sigma公司)；TNF-α(Abcam公司)；IL- 6、血管细胞黏附分子- 1(vascular cell adhesion molecule- 1,VCAM- 1)、细胞间黏附分子- 1(intercellular cell adhesion molecule- 1,ICAM- 1)、基质金属蛋白酶- 9 (matrix metalloprotein- 9,MMP- 9) ELISA试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、钙测试盒(南京建成生物工程研究所)；Von Kossa染液(武汉赛维尔生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分组及处理：将小鼠随机分为对照组(control)、模型组(model)、小檗碱组(BBR)和阿托伐他汀组(atorvastatain)，每组12只。高脂喂养4周，灌胃给予BBR 100 mg/(kg·d)治疗4周，同时继续高脂喂养。

1.2.2 病理染色及免疫组化：固定后的主动脉根部进行脱水，石蜡包埋并切片。进行苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察炎性细胞浸润和血管内壁斑块情况；Von Kossa染色观察血管钙化情况；进行BMP- 2、OPG、OCN和RUNX2的免疫组化，观察血管组织中4个指标的表达情况。

1.2.3 动物血液及组织中生化指标的检测：取心脏血，血液于 4 ℃、3 000 r/min 离心 25 min，收集血清。全自动生化仪检测血清中的TC、TG、LDL-C和HDL-C水平；ELISA试剂盒检测IL- 6、BMP- 2的表达；主动脉组织加入裂解液后进行超声匀浆后离心收集上清，化学发光法检测血清和组织匀浆中的ALP和钙含量。

1.2.4 细胞的分组及处理：收集对数增殖期的HUVECs细胞，以1×105个/mL 细胞接种于6孔板中，每孔2 mL，置于37℃、5% CO2培养箱中培养18 h贴壁后，随机分为6个组：对照组(control)；DMSO组(DMSO)，加入25 μg/L的TNF-α和0.1%的DMSO；BBR各处理组(7.5、10、15和20 mg/L)，分别加入25 μg/L的TNF-α和7.5、10、15和20 mg/L的BBR。继续培养24 h后收集上清，用ELISA试剂盒按说明书方法检测上清中ICAM、VCAM和MMP- 9的表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 BBR对高脂饮食小鼠的血脂调节作用

模型组小鼠8周后血脂TC、LDL-C含量较对照组显著升高(P<0.001)，BBR治疗组和阿托伐他汀组较模型组明显回降(P<0.05)(图1)。

2.2 BBR对小鼠主动脉形态变化和炎性浸润的影响

与对照组(图2A)相比，模型组小鼠主动脉内膜增厚，血管内壁有斑块突起，甚至有的已经脱落，炎性细胞浸润明显(图2B)。BBR治疗组和阿托伐他汀组AS病变均得到控制，未见斑块突起，内膜也较为平滑，炎性浸润明显减少，基本恢复正常水平(图 2C，D)。

2.3 BBR对主动脉组织中钙盐沉积的影响

模型组血管及斑块中可见大量褐黑色颗粒沉积，表明有大量钙盐沉积、典型血管钙化形成。给予BBR治疗的小鼠钙盐沉积明显减少，阳性药组效果不明显(图3)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with model group; ***P<0.001 compared with control group

A.control; B.model; C.BBR; D.atorvastatain图2 HE染色观察各组小鼠主动脉形态变化和炎性细胞浸润程度Fig 2 Recruitment of infiltrated inflammatory cell and morphology in aorta tissue stained with HE

2.4 BBR对主动脉组织中BMP- 2、OPG、OCN和RUNX2的表达量的影响

模型组小鼠主动脉AS斑块形成明显，BMP- 2、OPG、OCN和RUNX2表达量明显增多(图4)，尤其集中在斑块部位。BBR治疗组小鼠主动脉未见AS斑块形成，4个指标的表达量也比较少。

A.control; B.model; C.BBR; D.atorvastatain图3 Von Kossa染色观察各组小鼠主动脉钙盐沉积情况Fig 3 Calcium deposition in aorta tissues stained with Von Kossa

图4 小鼠主动脉组织中BMP- 2、OPG、OCN和RUNX2表达情况比较Fig 4 Comparison of BMP- 2，OPG，OCN and RUNX2 expression in mice aorta tissues(×400，n=5)

2.5 BBR对小鼠血清及血管组织中IL- 6、TNF-α、ALP、BMP- 2和钙含量的影响

模型组小鼠血清中IL- 6和主动脉血管组织中TNF-α表达明显升高(P<0.05)，BBR治疗组和阿托伐他汀组则明显回降(P<0.05)。模型组小鼠血清和组织匀浆中的ALP、 BMP- 2和钙含量明显增加(P<0.05)，BBR治疗组小鼠血清和组织匀浆中ALP、 BMP- 2和钙含量明显回降(P<0.05)(图 5)。

2.6 BBR对HUVECs细胞ICAM、VCAM和MMP- 9分泌的影响

对照组的HUVECs细胞上清液中ICAM和VCAM的水平较低，给予25 μg/L的TNF-α刺激后，HUVECs分泌ICAM和VCAM水平显著增加(P<0.001)，而BBR对TNF-α诱导的ICAM和VCAM分泌有明显抑制作用，且对于VCAM的抑制作用有浓度依赖性，15 mg/L的BBR可以抑制TNF-α引起的ICAM的分泌(P<0.05)(图6)，7.5、10和15 mg/L的BBR可以抑制TNF-α引起的VCAM的分泌(P<0.01)(图6)。与对照组相比，模型组HUVECs细胞上清中的MMP- 9水平显著增加，而BBR对TNF-α诱导的MMP- 9的分泌有明显抑制作用，7.5、10和20 mg/L能下调TNF-α诱导的MMP- 9的分泌(P<0.05)(图6)。

#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001 compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with model group

#P<0.05，##P<0.001 compared with control group；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with DMSO group

3 讨论

AS的发生会引起血管形态的改变，主动脉断面HE染色结果显示BBR可有效抑制血管内壁斑块的形成和炎性细胞浸润，通过抗炎作用缓解动脉粥样硬化的形成。本研究证实，高脂饮食的Apo-/-E小鼠体内IL- 6和TNF-α水平明显增高，给予BBR治疗后，这两种细胞因子水平明显下调。TNF-α和IL- 6均可诱导核因子NF-κB的表达上调，进而促进内皮细胞中VCAM- 1、 ICAM- 1的产生[3- 4]。因此，BBR可能通过抑制炎性介质的释放在血管内皮局部发挥抗感染作用。

AS的发病过程中涉及血管内皮的损伤，伴有VCAM- 1、 ICAM- 1和MMP- 9的表达上调[5]。本研究发现，通过TNF-α刺激，可诱导HUVEC产生炎性反应，模拟血管内皮的损伤，促进VCAM- 1、 ICAM- 1和MMP- 9的表达量明显上调，而BBR可以抑制上述蛋白表达的上调，提示BBR可能通过抑制VCAM- 1、ICAM- 1和MMP- 9的分泌来发挥内皮保护作用。

血管钙化是导致主要心血管事件的重要危险因子，血管钙化伴有BMP- 2等促进血管平滑肌细胞向成骨样细胞方向转化的因子的表达上调[6]，并引发下游通路中Runx2、OPG和OCN的表达上调，进一步促进钙化的发展[7- 8]。有文献报道，炎性反应是动脉粥样硬化和糖尿病中血管钙化的催化因素，炎性因子例如TNF-α的释放上调BMP- 2的表达，促进了血管钙化[9]。本研究结果表明，在高脂饮食小鼠的血浆和组织中，ALP、BMP- 2、OPG、OCN、RUNX2和钙的水平都明显增高，斑块处尤其明显，给予BBR治疗后明显下调，接近正常水平。阿托伐他汀对血管钙化相关指标的影响并不明显，证明BBR具有缓解血管钙化的作用，提示BBR可能是通过抑制了ALP和BMP- 2通路中的BMP- 2、OPG、OCN和RUNX2因子缓解了血管钙化，从而间接发挥了缓解AS的作用。

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