胎儿非整倍体产前诊断的研究进展

计德永+王虎+贾文娟+方立异+许克义

[摘要] 产前诊断（prenatal diagnosis）是指在出生前对胚胎或胎儿的发育状态、是否患有疾病等方面进行检测诊断。通过遗传咨询，应用现代分子生物学技术，结合免疫遗传学、细胞遗传学、分子遗传学等学科，通过母体检查或对胚胎（胎儿）直接检测，了解胎儿在子宫内的生长发育状况，诊断胎儿是否有遗传缺陷及先天畸形。本文就各种产前诊断方法、最新技术、存在的不足与困难及发展前景综述如下。

[关键词] 产前诊断；胎儿细胞；荧光原位杂交技术；光谱核型分析；胎儿游离DNA

[中图分类号] R714.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）35-0161-04

[Abstract] Prenatal diagnosis refers to the detection and diagnosis of embryonic or fetal developmental state， and whether the fetus is suffering from diseases before birth. Through genetic counseling， disciplines such as modern molecular biology techniques， integrated immune genetics， cytogenetics and molecular genetics are applied. Through maternal examination or direct detection of the embryo （fetus）， the growth and development status of the embryo in the uterus are understood， and whether the fetus has genetic defects and congenital malformations can be diagnosed. In this paper， a variety of prenatal diagnosis methods， the latest technology， existing shortcomings and difficulties， as well as development prospects are reviewed below.

[Key words] Prenatal diagnosis； Fetal cells； Fluorescence in situ hybridization； Spectrometric karyotyping； Fetal free DNA

我国是出生缺陷的高发国，据统计，每120～150个新生儿中就有一个染色体异常者，每年新增出生缺陷数约为90万例，染色体病是最为严重的出生缺陷之一[1]。21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征这三种是发病率较高的常染色体病，以非整倍体异常多见。其中21-三体综合征在新生儿的发病率最高，约占1.2‰～1.7‰，21-三体和18-三体约占围生期出生缺陷的0.15%，占围生期常染色体非整倍体的95%左右[2]。染色体病患者大多伴有严重的智力发育障碍和严重的某些组织畸形等，且目前尚无有效的治疗措施，因此加强产前诊断以便降低先天缺陷患儿出生率成为学者们研究的热点。

1 胎儿非整倍体的产前筛查方法

1.1 孕妇年龄筛查

孕妇妊娠唐氏综合征胎儿的危险度与年龄呈正相关，当孕妇年龄超过30岁后，危险度随之升高，尤其是当孕妇年龄超过35岁时则被列为妊娠唐氏综合征胎儿的高危人群。不同年龄孕妇妊娠唐氏综合征胎儿的个体危险率可根据年龄相关危险率（age-speciflc risk，ASK）=1/[0.000627+exp（-16.2395+0.286×age）]-1公式进行计算。但是孕妇年龄筛查的阳性率不高，约为30%左右，因为约80%的妊娠均发生在年龄较轻的女性中。但孕妇年龄相关的危险度，仍被与多种血清指标或超声联合进行筛查[3]。

1.2孕妇血清学筛查方法

应用于产前筛查的孕妇血清中的标记物从最初的AFP、hCG等已经发展到目前的10多种，并且新的标记物在不断的发现中[4]。单个的血清标记物作为筛查指标时存在准确性低，假阴性和假阳性的缺点，因此常采用多项指标的联合筛查，从二联、三联到六联、七联不等。临床上孕中期常使用AFP、β-hCG、μE3的三联组合，能够筛查出65%～75%的Down综合征胎儿。1997年美国使用AFP、hCG、CA-125（或Inhibin-A），使阳性检出率提高到90%。还有一些不断探索中的血清标记物，如SP-1、PIGF、SOD、URNAP等[5]。

1.3 超聲筛查

高分辨超声技术在产前筛查和产前诊断中应用也越来越广泛，不仅可以筛查胎儿有无明显外在肢体畸形、胎儿神经管缺陷外，还可运用超声筛查唐氏综合征[6]。常用的超声筛查唐氏综合征的指标有胎儿颈项透明带厚度（NT）、胎儿双顶径与股骨长度之比、双顶径与肱骨长度之比。超声测量胎儿颈项透明带厚度（异常标准≥3.0 mm）在孕早期筛查唐氏综合征阳性检出率可达73%。有研究显示若将超声测量胎儿颈项透明带厚度、妊娠相关血浆蛋白A（PAPP-A）、游离β-hCG和孕妇年龄4个参数联合应用，对孕10～14周唐氏综合征的检出率可达80%。此外，超声发现羊水过多、十二指肠闭锁、肾盂扩张或心脏异常均提示唐氏综合征的风险升高，且多项指标异常提示患儿的风险更大[7]。

2 胎儿非整倍体的产前筛查最新方法

2.1 细胞遗传学产前诊断方法

绒毛组织检查孕早期绒毛组织检查常在孕7～9周进行，在超声监测下，从胎盘边缘取少量绒毛组织做染色体核型分析，绒毛既可以培养后做也可直接做核型分析，此方法优点是将产前诊断的时间提早到孕早期，缺点是诊断的可靠性不如羊水细胞，另外引起流产和感染的风险比较高[8]。endprint

羊水穿刺常规羊膜腔穿刺术通常在16～20周进行，最佳穿刺时间为18～20周，此时子宫已出盆腔，羊水量达250 mL，穿刺不易伤及胎儿，且羊水中有活力的细胞比例最高，结果更可靠。缺点是产前诊断的时间比较晚，同样是有创的，有引起感染和流产的风险。但羊水穿刺诊断染色体异常的可靠性超过99%[9]。

脐血细胞检查脐血穿刺常在孕早期没有做绒毛膜抽吸术、孕中期没有做羊水穿刺，在孕期稍晚时选用。此法可以直接检测胎儿的染色体有无异常，准确性高，但是反复的脐带穿刺可致穿刺点出血造成胎儿急性贫血，严重者可致胎儿及新生儿死亡[10]。

细胞遗传学检查，随着技术的发展，安全性较以前有所提高，但仍有出血、感染和流产的风险，作为侵入性的有创检查手段，对母亲和胎儿的危险性约为1/500～1/1000，甚至可能造成胎儿的丢失，报告结果出来的时间比较长，但是此类检查的精密度和准确性高，目前仍為产前诊断的金标准[11]。

2.2 分子遗传学产前诊断方法

荧光原位杂交（FISH）技术采用染色体区带上特异性的DNA经荧光标记后作为探针，与分裂期或间期细胞原位杂交后，通过荧光显微镜来观察染色体畸变的技术[12]。最常采用的13、18、21、X与Y染色体这5个探针，可筛查出约80%～90%的主要染色体病。FISH技术不受细胞周期的影响，间期细胞即可作为标本，因此周期大大缩短，在24～48 h内可完成快速诊断。但是FISH技术检测成本较高，也更耗费人力，无法一次性将所有染色体进行分析，容易漏检某些结构性染色体重排。

定量荧光多聚酶链式反应（QF-PCR）技术是将被检测的标本DNA采用荧光引物PCR方法，扩增特异重复的DNA序列，即短串联重复序列（STRs），应用自动化DNA测序仪和基因扫描软件检测额重复序列长度得到峰面积值而实现定量。该技术近年来在欧洲的快速产前诊断中应用的越来越广泛[13]，具有快捷、方便、省时省力的优点，检测结果可在标本收集的24～48 h内得到，这一点对于早期妊娠异常的及时处理极为有利。但该方法检测结果正常仍然不能排除染色体畸形的风险，并且无法检测出染色体嵌合型和易位型[14]。

光谱核型分析技术（SKY）是应用在多个光谱上有重叠的染色体涂染探针与中期染色体进行原位杂交，对其发射光谱的所有信息进行分析的一项技术。该技术的优点是可以同时对24条染色体分别用不同的探针进行涂染，然后在荧光显微镜下获得不同颜色的24条染色体的图像并进行光谱分析[15]。但是该技术成本昂贵，无法在临床大规模推广。同时对于染色体的微小缺失、重复及插入依然容易漏诊。

2.3孕妇外周血中胎儿有核红细胞用于检测染色体非整倍体疾病

1960年在孕妇外周血中发现男胎的细胞分裂相，提出了母血中可能存在胎儿细胞的假说。随着在1979年首次从孕妇血中分离出胎儿细胞，此后的研究主要针对胎儿的有核红细胞的分离，因为它携带了胎儿基因组DNA的全部遗传信息。但是胎儿细胞在孕妇外周血中含量非常稀少，且富集技术价格昂贵、效率低、灵敏度也不高，在一定程度上限制了它的应用和发展[17]。

2.4 孕妇外周血中胎儿游离DNA在无创性产前诊断染色体非整倍体疾病

1997年，Lo M等[8]在怀有男胎的孕妇外周血中检测出胎儿Y染色体特异性的DNA序列，这对无创性产前诊断方法的改进产生了巨大的影响。胎儿游离DNA最早可能在怀孕5周后的母血中测出，母血中胎儿游离DNA可能来源于进入母体的胎儿细胞受到母体免疫系统的攻击而发生溶解后释放所得，或是胎儿发育过程中细胞凋亡后DNA释放出来而进入母血中[18]。研究发现，怀有染色体非整倍体胎儿的孕妇，其外周血中胎儿游离DNA的浓度高于怀有正常胎儿的孕妇，但在孕11～17周，母体的游离DNA占绝大多数，胎儿的游离DNA含量只占母血浆DNA总含量的3.4%（0.39%～11.9%）左右[19]。如何提取胎儿DNA和减少母源性的DNA的干扰，就需要增加提取的胎儿DNA浓度或抑制母体DNA浓度，减少背景DNA[20]。有研究显示[21]，母血中胎儿DNA分子一般比母体DNA分子要短，绝大多数不超过313bp，而母体的DNA分子长度一般在1000bp以上。另外，母亲与胎儿的DNA的甲基化存在差异性[22]，如18号染色体上的mapsin基因、3号染色体上的rassfla基因、21号染色体上的aire、erg和hlcs基因及DSCR4基因可以区分母体核酸，排除其干扰。

3 存在的困难和不足

产前诊断是我国母婴保健工程的重要组成部分，可以有效降低先天缺陷患儿的出生率。产前基因诊断是现代医学的一个新分支，与临床各科室都有密切的联系，产前诊断的技术发展也是日新月异[23]。目前我国产前诊断还面临着一些困难和不足：①缺乏完善的科室配置。目前，除了一些较大的综合医院和专科医院外，大部分医院都没有开展产前诊断的实验室。有的实验室设在科研院所，造成了临床和实验室难以协调。②缺乏合格的专业人员。产前诊断横跨很多学科，涉及的技术多样，需要特殊的技术培训，一般的临床医生很难通过短期培训达到预期目的。③产前诊断是高风险的项目。不同于一般的检验项目，国内也缺乏相应的保护机制。④产前诊断的收费定价太低。⑤缺乏资金的支持。产前诊断最主要的任务是减少出生缺陷，提高全民族素质。它是一项科技含量高、投入高的项目，且带有公益性的特点，由于管理部门对其重要性认识不足，导致资金投入不足。⑥宣传教育不足。一方面患者对产前诊断缺乏了解，仍然有盲目生育的现象，另一方面，许多临床医生缺乏对产前诊断相关技术的了解，不能正确的进行遗传咨询。

4 发展前景

产前诊断的方法众多，不同的诊断方法各具特点[24]。目前多数的产前诊断需做侵入性的检查，对孕妇和胎儿有一定的创伤和风险。随着产前诊断技术的不断发展，人们对产前诊断的认识也在不断提高，同时新的诊断技术也不断应用于临床。相对于侵入性的产前诊断技术，分子遗传诊断技术是在基因水平进行的[25]，样本量少、非特异，敏感性高，可在孕早中期进行诊断。相信随着分子生物学技术和分子遗传学技术的不断发展和创新，高精确度、低成本、省时省力的检测手段在不久的将来将服务于临床。endprint

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（收稿日期：2017-11-12）endprint