骨骼肌中与运动相关蛋白质组学的研究进展

2018-01-27张海滨田雪文

体育世界(学术版) 2018年8期

张海滨田雪文

运动训练作为最佳的非药物学策略，在多种病理生理条件下能够预防或减轻骨骼肌萎缩及损伤，对机体健康产生积极效应。骨骼肌对收缩刺激具有显著的可塑性。在不同运动训练刺激下，骨骼肌分子和形态产生不同适应性，以满足其功能需求。尽管运动可以促进骨骼肌在收缩特性、线粒体功能和血管生成等方面的重塑，但运动诱导骨骼肌重塑反应的信号通路和分子学机制尚未明确。由于基因仅仅是遗传物质的载体，同一组基因在不同阶段或环境下转录翻译后表达的蛋白质不同，所产生的生理功能不同。随着后基因时代的发展，蛋白质组在基因组基础上被提出，蛋白质组学研究开始受到国内外科研工作者的青睐。蛋白质组学是在特定刺激条件下，对单一细胞或组织基因组翻译后表达的所有蛋白质特质进行分析的科学。基于质谱和生物信息学的蛋白质组学，能够确定与运动训练相关的骨骼肌重塑潜在分子标记，综合观察运动刺激反应的分子通路，更好的解释运动训练对骨骼肌重塑的影响。本文通过综述蛋白质组学相关技术，及其对运动训练诱导骨骼肌重塑的影响，以促进蛋白质组学相关技术在运动人体科学领域的应用。

1. 骨骼肌差异蛋白分析的蛋白质组学技术

蛋白质组学能够分析骨骼肌复杂混合物中的单个蛋白质，因此可以更深入地了解肌肉多样性和可塑性。然而因肌纤维类型不同、骨骼肌之间异质性以及方法学方面的因素，对骨骼肌进行全面蛋白质组学分析仍存在一定的挑战。骨骼肌作为高能量需求的重要组织，线粒体无疑成为蛋白质组学研究的重点。骨骼肌释放的作用于机体局部或全身的分泌蛋白也是蛋白质组学研究的目标。借助差速离心、流式细胞术等分离纯化技术提取出骨骼肌或其亚细胞蛋白质组样品，就可使用基于凝胶或非凝胶方法结合标记或无标记的定量策略进行大规模蛋白质组学研究。蛋白质组学研究主要涉及蛋白质组表达模式和蛋白质组功能模式两方面的研究，目前大部分集中在蛋白质组表达模式方面。这方面的蛋白质组学相关技术主要指蛋白质分离技术，质谱技术和生物信息学。

1.1 蛋白质组的凝胶分离技术

双向凝胶电泳技术(2-DE)是分离蛋白质最常用的蛋白质组学技术。其原理是第一向中根据蛋白质在特定PH环境的等电点不同利用等电聚焦分离，在第二向中则按照其分子量不同利用SDS-PAGE分离，将骨骼肌复杂混合物中的单个蛋白质在二维平面上分开。双向差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)是一种荧光标记定量蛋白质组学技术。2D-DIGE是唯一使用内参标志物，并支持在一张凝胶中分离多个样品且单个成像的蛋白电泳分离技术。该技术基于蛋白质赖氨酸残基中加入不同荧光的氰化物染料用来标记不同蛋白质组学样品，随后利用2-DE技术进行同位素分离保证了样品所有蛋白质位置的共同移动，从而减少凝胶或凝胶变异产生的潜在错象。2D-DIGE分离后用胰蛋白酶对存在于凝胶中条带或斑点酶切以及质谱分析，可鉴定大约3500个蛋白质点，这为深入研究蛋白质组学提供了更多机会。在高强度运动训练(HIT)诱导骨骼肌适应性的2D-DIGE蛋白质组学分析显示，鉴定出的800个检测点和匹配点中，HIT组与久坐组相比有13个蛋白质发生变化。

1.2 蛋白质组的非凝胶分离技术

随着蛋白质组学研究的深入，突破凝胶电泳中等电点和分子量限制的非凝胶蛋白分离技术，能够在更广泛的动态范围内覆盖蛋白质组。具有正交分离能力的多维液相色谱法(MDLC)被广泛使用。最典型的是复合肽混合物通过二维液相色谱(2D-LC)结合强阳离子交换和反相，允许肽借助电荷和疏水性完成分离。将高效液相色谱柱用自动串联质谱仪鉴定，可有效减少样品损失量分析出低丰度蛋白质，提高蛋白质组分离成功率。Sollanek等人在运动诱导膈肌表型变化的研究中，使用非标记液相色谱-质谱法对膈肌中分离的可溶性蛋白质和线粒体蛋白质分析显示，膈肌膜蛋白质总数分别是813和732。耐力运动训练显著改变可溶性膜蛋白组中70种蛋白和线粒体蛋白组中25种蛋白质的丰富度。

1.3 蛋白质组学的凝胶液相色谱-质谱技术

为了进一步提高蛋白质组的分离效率，将凝胶和液相色谱结合使用的凝胶液相色谱-质谱技术实现了对蛋白质的多维分离鉴定。其操作流程一般是通过电泳分离蛋白质，切取凝胶中蛋白条带或斑点，首先进蛋白酶酶切，最后借助液相色谱-质谱(LC-MS/MS )鉴定蛋白质。同位素的相对与绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ) 技术通过2-DE凝胶差异蛋白分析结合1-DE凝胶泳道中胰蛋白酶肽的定量分析，对骨骼肌中多达4或8个样品多重分析，实现差异蛋白评估。iTRAQ标记是在肽水平上完成的，蛋白质定量则基于离子强度或MS / MS分析后鉴定蛋白质的光谱计数。Holloway 等人采用iTRAQ技术在股外侧肌运动训练干预前后的活检研究中发现，2-DE解析了256个蛋白质点，配对t检验发现了20个表达差异。尽管使用高分辨率质量分析的混合质谱仪对定量蛋白质组学进行了改进，但其高昂的成本费用，标记效率的可变性以及低丰度肽的低分辨率等不同程度局限该技术的广泛应用。在运动诱导骨骼肌蛋白质组可塑性的表征中获得的大部分数据来自2-DE研究。

1.4 蛋白质组学数据的生物信息学

蛋白质组学研究的主旨是通过对差异表达蛋白的分离鉴定，描绘出骨骼肌在特定条件刺激下的调节分子通路。蛋白质组学信息学通过对蛋白质组实验数据的收集和加工，构建双向电泳图谱数据库能够优化蛋白鉴定；并且辅助分析蛋白质之间的相互作用，构建出机体蛋白质调节网络。BINGO和ClueGO等生物信息学工具描绘了鉴定出的蛋白质潜在功能和机体生理变化的动态相关性，有助于阐明运动训练诱导骨骼肌重塑反应的分子学机制。

2. 运动对骨骼肌蛋白质组学的影响

运动对骨骼肌重塑起到了良好的促进作用，运动作为独立的外界环境应激因素能够引起骨骼肌产生不同程度的收缩反应。骨骼肌对收缩刺激具有显著的可塑性，蛋白质组学随之发生变化。从蛋白质组水平研究骨骼肌在运动适应中的变化，蛋白质组学技术能够从动态、整体的视角更好的揭示了骨骼肌在运动反应和适应过程中蛋白质组的变化特征。这可能发现新的骨骼肌损伤标记物，对预防骨骼肌损伤具有重要意义。

2.1 有氧运动对蛋白质组学的影响

有氧运动对骨骼肌重塑的促进作用，主要体现在对线粒体能量代谢和细胞膜修复相关蛋白丰度的提高。尹苗苗等人在有氧运动对小鼠骨骼肌蛋白表达影响的研究中发现，蛋白质组学鉴定出6种与线粒体能量代谢、细胞膜修复和糖代谢相关的差异性蛋白表达均成倍上调，这提示有氧运动与骨骼肌重塑密切相关。Kurt等人研究运动诱导膈肌表型变化的结果显示，耐力运动训练后几种关键蛋白的丰度相对增加，包括线粒体蛋白18(MTP18)、3-巯基丙酮酸硫酸转移酶(3MPST)、微粒体谷胱甘肽S-转移酶3(Mgst3)和热休克蛋白70kDa蛋白1A / 1B(HSP70)。这些蛋白在几种细胞类型中具有细胞保护作用，尽管在膈肌纤维中的细胞保护作用尚未完全被阐明，但是暗示了耐力运动预防非活动性肌肉萎缩的功能。Simona等人在研究低强度耐力运动恢复mdx小鼠受损骨骼肌的研究中发现，与久坐mdx小鼠相比，进行锻炼的mdx小鼠股四头肌中有四个蛋白质点显著改变。经蛋白质组学鉴定为三种碳酸酐酶3(CA3)同系物和超氧化物歧化酶(SODC)。在锻炼的mdx小鼠股四头肌中，CA3亚型的蛋白水平明显上调，并完全恢复到野生型(WT)小鼠的值。而SODC的蛋白水平显著下调，并恢复到WT小鼠的值。根据本研究中发现的数据，低强度耐力运动似乎可以通过对抗氧化应激来减少mdx肌肉中的细胞退化过程。另有研究表明，骨骼肌对运动训练的主要反应是线粒体电子传递链，三羧酸循环和线粒体呼吸链复合物I装配的蛋白质更丰富。而肥胖/2型糖尿病(T2DM)个体中这三类蛋白质丰度较低，并且耐力训练的个体骨骼肌更丰富。这提示运动诱导机体防御肥胖和葡萄糖不耐受和T2DM的有害作用主要机制之一发生在电子传递链的复合物I上。

2.2 无氧运动运动对蛋白质组学的影响

无氧运动引起骨骼肌差异蛋白的数量相对较少。Kym等人，应用定量蛋白质组学研究个体腓肠肌蛋白的水平是否受短时间高强度运动影响时发现，腓肠肌蛋白质水平一般不受短时间高强度运动的急剧影响，双向凝胶电泳选择的61个蛋白质点中仅有4中显著变化。使用液相色谱电喷雾电离-串联质谱鉴定这些变化的蛋白质为肌酸激酶，肌钙蛋白，热休克20kDa蛋白和腺苷酸激酶1的组合。这也表明，大多数个体骨骼肌蛋白质水平不会立即改变，以相应短时间的高强度运动，也提示定量蛋白组学对于检测骨骼肌蛋白水平的剧烈变化非常敏感。同样地，Yamaguchi等人研究大鼠进行游泳高强度间歇后骨骼肌适应性变化时发现，蛋白质组学分析显示，在800个检测点和匹配点中，与对照组大鼠相比，高强度间歇游泳后大鼠只有13个蛋白质表现出变化。此外，利用western免疫印迹分析，高强度间歇运动对呼吸链电子传递相关蛋白(NDUFS1)和小清蛋白(parvalbumin ，PV)的表达进行了显著改变。