呼吸机相关性肺炎患者血与痰标本中分离的鲍曼不动杆菌分子流行病学分析

王露霞，郑英俊， 郭振辉，李 理， 王晓雅， 李建勋， 卓 超

鲍曼不动杆菌是临床重要条件致病菌，具有容易获得耐药性及传播的特点。感染类型包括医院获得性肺炎（HAP）、尿路感染、中枢神经系统感染、创口感染、菌血症等，尤以呼吸机相关性肺炎（VAP）最常见。一项亚太地区有关HAP/VAP流行病学调查（ANSORP）表明鲍曼不动杆菌的分离率在HAP/VAP居于前3位，约20%～40%，其中中国HAP/VAP的分离率都居第1位，分别为16.2%和35.7%，且几乎全为多重耐药株，对碳青霉烯类耐药率超过50%[1]。鲍曼不动杆菌HAP/VAP合并血流感染带给临床更大的挑战，其病死率高于单纯HAP患者，并且鲍曼不动杆菌性肺炎继发血流感染的病死率（35.6%）也高于其他原因所致的鲍曼不动杆菌血流感染病死率（7.3%）[2]。鲍曼不动杆菌HAP进展为HAP合并血流感染的机制并不清楚，虽然有报道提示，初始不恰当的抗生素治疗、严重的基础疾病等临床危险因素可导致鲍曼不动杆菌HAP进展为菌血症[3-4]，但有关病原学本身在其中所起作用却鲜有报道。为此，本研究通过对照研究，从鲍曼不动杆菌的分子流行病学特征入手，研究病原学在鲍曼不动杆菌肺炎进展到合并血流感染中所起作用，为临床早期防控鲍曼不动杆菌感染提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

所有菌株来自2015年6－12月入住我院ICU、内科（M）ICU VAP患者痰培养、血培养分离出的鲍曼不动杆菌，剔除来自同一患者同一标本的重复菌株。3株参考菌株：不动杆菌基因种型13TU（Acinetobacter nosocomialis）、不动杆菌基因种型3（Acinetobacter pittii）和鲍曼不动杆菌由浙江大学邵逸夫医院俞云松教授惠赠。

1.2 研究方法

1.2.1 病例分组和诊断标准 入选患者符合美国ATS/IDSA 2005年HAP/VAP诊断标准[5]。若患者符合相隔48 h内出现血培养及痰培养鲍曼不动杆菌阳性两个条件，且血培养阳性为双瓶以上，归为VAP合并血流感染组，称A组；若患者血培养为阴性，仅痰培养出鲍曼不动杆菌为B组（鲍曼不动杆菌呼吸感染/定植）。若患者血培养有鲍曼不动杆菌以外的细菌则不纳入本研究分析。

1.2.2 临床资料收集 查阅患者临床资料、实验室数据。统计两组患者基本信息，入住ICU、MICU时间，是否接受侵袭性操作以及采取痰或血标本日期±1 d的各项临床征象等指标。

1.2.3 菌株鉴定和药敏试验 菌株鉴定及药敏采用全自动微生物系统VITEK 2-Compact仪器（法国生物梅里埃公司）。有关鲍曼不动杆菌复合体中3个基因型（13TU、不动杆菌基因种型3和鲍曼不动杆菌）的鉴定则参照文献[6]方法以16S-23S rRNA予以分类 。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853和大肠埃希菌ATCC25922。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳（PFGE） 参照文献 [7]：制备胶块、裂解细胞、洗胶、胶块DNA酶切、加样、电泳等；①条带完全相同判断为克隆株；②条带差异1～3条判断为克隆亚型；③条带差异4～6条判断为可能克隆亚型；④条带差异大于7条以上判断为非克隆株。用生物学软件 BioNumerics结合肉眼比对将PFGE 结果进行非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析。

1.2.5 多位点序列分型（MLST） 分析提取细菌DNA模板，参照文献报道制定的MLST引物设计方案[8]，PCR扩增gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi、rpoD共7个管家基因，引物见表1。PCR扩增产物进行测序，产物序列与鲍曼不动杆菌MLST数据库（http：//pubmlst.org/abaumannii/info/primers.sht）进行比对。若MLST数据库中查找不到测序结果所得到的ST型，经核实后，确认为新的ST型，新的管家基因序列和ST型及菌株相关资料上传到数据库。

1.2.6 数据统计分析 采用WHONET 5.6进行药敏数据分析，采用SPSS17.0进行原始数据分析，计量资料比较采用t检验，不同分类构成比的计数资料比较采用卡方检验。危险因素分析采用COX回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 管家基因引物序列及产物长度Table 1 Primer sequences for housekeeping genes and the corresponding product size

2 结果

2.1 菌株分型及相关临床信息

入选A组患者14例，获得鲍曼不动杆菌非重复菌株28株（同一患者血和痰标本各计1株）；入选B组28例患者仅痰培养出鲍曼不动杆菌，获得非重复菌株28株。由于在临床实际工作中无法通过常规的方法鉴别鲍曼不动杆菌的种属，故统一报告为鲍曼不动杆菌复合体，借助16S-23S rRNA基因间区特征进行准确鉴定。A组28株菌中，有26株菌16S-23S rRNA基因间区序列比对结果与鲍曼不动杆菌相似度大于99%，鉴定确认为鲍曼不动杆菌；2株菌与Acinetobector pittii相似度大于99%，确认为Acinetobector pittii。B组28株菌中，有26株菌鉴定确认为鲍曼不动杆菌，1株菌为Acinetobector pittii， 1株菌为Acinetobector nosocomialis。临床信息显示，A组入住ICU的天数为（18.93±17.00）d，14-day死亡14例（50.0%）；B组的入住ICU天数为（21.61±13.80） d，14-day死亡4例（14.3%）。其余临床征象指标差异无统计学意义。见表2。

2.2 药敏试验结果分析

两组鲍曼不动杆菌体外对10种抗菌药物的耐药率均达到50.0%～100%，仅替加环素对鲍曼不动杆菌有较好的抗菌活性。两组间药物敏感性差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.3 菌株PFGE 分析

A组14例患者的各自血与痰标本分离株均为同一克隆；28株菌株分为6个克隆型， A、B、C、D、E、F型克隆株分别为8株、6株、4株、4株、4株、2株； B组28株分为9个克隆型，其中包括A组中A-E 5个克隆型，共21株，其余7株为G型（3株）、H型（2株）、J型（1株）和K型（1株）。

2.4MLST分型

56株鲍曼不动杆菌通过MLST分为13个ST型，其中ST 195、ST 208、ST 457、ST N2构成比分别为28.57%、19.05%、11.90%、14.29%，为主要流行株。有5个新的ST型（分别以N1、N2、N3、N4和N5表示），其已知ST型仅有1个或2个管家基因的差别，亲缘关系较近，多见于管家基因gpi和gyrB的差异。A组与B组的ST 195、ST 208、ST 457、ST N2主要流行株的分布差异无统计学意义（P ＞  0.05）。见表4。

表2 A组与B组各项临床指标对照比较Table 2 Clinical data compared between patients with A. baumannii isolates from blood and sputum and those with A. baumannii isolates only from sputum

表3 两组分离鲍曼不动杆菌对常见抗菌药物的耐药率比较Table 3 Antimicrobial resistance rates of Acinetobacter baumannii isolates compared in terms of specimen source

2.5MLST分型同源性分析

结合分型结果和PubMLST数据库，使用eBURST软件进行菌株基因同源性分析，56株鲍曼不动杆菌共发现13个ST型，其中7个ST型（ST 195、ST 208、ST 457、ST 369、ST N1、ST N2、ST N5）属于克隆复合体92（clonal complex 92，CC92），CC92不同ST型关系进化见图1，CC92占所有菌株的83.3%。属于同一个克隆复合体的各个ST型之间仅有1个或2个管家基因的差别，亲缘关系较近，多见于管家基因gpi和gyrB的差异。CC92菌株比例在A组和B组中的分布，并未发现差异（P＞0.05），见表4和图1。

3 讨论

鲍曼不动杆菌是我国近年医院感染中最常见的、最难治疗的细菌之一。一方面，鲍曼不动杆菌几乎都为多重耐药，且对碳青霉烯类耐药率也超过50%，使临床可选用的抗菌药物很有限；另一方面，该菌最常见于患者下呼吸道，临床很难判断其是感染菌还是定植菌，常导致过度治疗或治疗不足的矛盾。然而，近年流行病学调查发现，鲍曼不动杆菌血流感染的比例呈上升趋势，大多继发于HAP或VAP，而且与单纯的肺炎相比，患者往往感染严重，病情进展快，病死率较高[1]。据文献报道，患者入住ICU时间、机械通气、行连续肾脏替代疗法、置中心静脉导管为鲍曼不动杆菌血流感染的危险因素[9]。同时，来源于血流感染的鲍曼不动杆菌也常表现为多重耐药甚至广泛耐药，使临床治疗更是面临困境。一项有关肿瘤患者合并广泛耐药鲍曼不动杆菌菌血症的临床研究显示，63%患者在确诊血流感染后给予了恰当的抗菌药物（包括多黏菌素），但30 d病死率仍然达到83.7%，且死亡原因主要与感染严重有关[10]。本研究也发现，来源于VAP合并血流感染组患者的14 d病死率达50%，而未合并血流感染组患者的14 d病死率仅为14%。虽然比较两组多项与血流感染有关的危险因素，未发现有统计学差异，但这不排除本研究样本量较小所致的统计偏倚。

表4 A组与B组各ST型分布比较Table 4 Distribution of ST types compared between Acinetobacter baumannii strains in terms of specimen source

图1 56株鲍曼不动杆菌基因同源性分析结果Figure 1 Analysis of the genetic homology for 56 strains of Acinetobacter baumannii

有关鲍曼不动杆菌血流感染的危险因素多集中于宿主因素分析，而关于病原学分子特征的分析报道较少。Chuang 等[11]分析了鲍曼不动杆菌复合体中3个种类致菌血症患者的临床特征，发现多重耐药株多出现于鲍曼不动杆菌，而且患者的病死率也高于种型13TU和种型3。本研究也得到类似结论，A组和B组菌株几乎都属于鲍曼不动杆菌，而且多为多重耐药株。为此，进一步对两组鲍曼不动杆菌进行ST型分析，发现ST 195、ST 208、ST 457、ST N2型占到了总菌株数的73.8%，为主要流行株。而既往报道，ST195及ST457也正是广东省鲍曼不动杆菌最常见的ST型序列[12]，由此也提示，主流克隆株的长期存在是导致临床鲍曼不动杆菌感染/定植高发的重要原因。同时，发现两组中ST型分布无差异，均以ST 195、ST 457、ST N2为主要ST型，eBURST分析显示这几种ST型属于CC92， CC92不仅在国内表现为主要的流行克隆复合体，同时也呈现全球范围流行趋势[13-14]。CC92群中两个管家基因gpi和gyrB容易突变，衍生更多的新亚型，如本研究发现的STN1、STN2和STN5。因此，加强对鲍曼不动杆菌CC92克隆的主动监控，防止其在病区内传播，对于降低鲍曼不动杆菌感染和病死率尤为重要。

总之，通过对照研究，分析鲍曼不动杆菌在肺炎合并血流感染中，细菌分子流行病学特征，结果表明，本研究并未发现国外报道的高毒力鲍曼不动杆菌ST10型菌株[15]，本院鲍曼不动杆菌肺炎合并血流感染仍以CC92流行克隆为主。而宿主方面的病情程度是合并血流感染的主要危险因素。

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