白芍配方颗粒指纹图谱及7种主要成分含量测定研究

陈巧华+范世明+许春芳

【摘要】 目的：建立白芍配方颗粒的指纹图谱，并对其7种主要成分进行含量测定，为白芍配方颗粒的质量控制提供实验依据。方法：本研究采用HPLC-DAD法，色谱柱为Inetsil-ODS-SP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）–0.1%甲酸水溶液（B）进行梯度洗脱，流速0.8 ml/min，柱温30 ℃，检测波长233 nm和270 nm，测定了10批次白芍配方颗粒。结果：指纹图谱检测结果，共确定白芍配方颗粒20个共有峰，各批次白芍配方颗粒指纹图谱与对照图谱相比，相似度均在0.900以上；含量测定结果表明，7种主要成分的峰面积和质量浓度的线性关系良好，r均大于0.999，平均加样回收率96.0%～98.6%。結论：本文建立了白芍配方颗粒的HPLC指纹图谱和和其中7种成分含量测定方法，可以为白芍配方颗粒质量控制提供参考。

【关键词】 白芍配方颗粒； HPLC； 指纹图谱； 质量控制

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.36.001 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2017）36-0001-04

【Abstract】 Objective：A method of fingerprint and simultaneous quantitative analysis of seven components by high performance liquid chromatography（HPLC） was developed and validated for quality evaluation for Baishao Granules.Method：The method was performed by HPLC using Inetsil-ODS-SP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） with a mobile phase of consisted of acetonitrile（A）-0.1% formic acid（B） in gradient mode at a flow rate of 0.8 ml/min；column temperature 30 ℃；wavelength set at 233 nm and 270 nm.10 batches of Baishao Granules were measured.Result：For fingerprint analysis，20 peaks were selected as the common peaks to evaluate the similarities among 10 batches of Baishao Granules collected from different regions with similarity higher than 0.900.Additionally，simultaneous quantification of seven markers，including gallic acid，methyl gallate，catechin，albiflorin，paeoniflorin，pentagalloylglucose and benzoylpaeoniflorin，were performed and the obtained data demonstrated that the method had achieved desired linearity（r>0.999），average recovery were ranged from 96.0% to 98.6%.Conclusion：The results indicated that HPLC fingerprint and simultaneous quantitative analysis of seven components was applicable in quality control of Baishao Granules.

【Key words】 Baishao Granules； HPLC； Fingerprint analysis； Quality control

First-authors address：The Second Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China

中药配方颗粒是中药材临床应用的另外一种形式，是符合炮制要求的中药饮片在中医药理论指导下，应用现代制剂工艺生产制成的供临床使用的颗粒剂，它克服了传统中药饮片调配称量不够准确、服用剂量不易掌握、临用煎煮、候药时间较长和携带不方便等缺点[1-3]。但中药配方颗粒所含有的活性成分往往多而复杂，单一化学成分均不能体现出中医临床用药的整体疗效[4-5]。中药指纹图谱是一种以“指纹”来质控中药的新方法，通过多批次样本的化学计量学分析，较为全面地反映中药内在多指标共有峰的情况，体现中医药的整体性；另外，在指纹图谱评价的基础上，选择合适的特征共有峰，进一步针对配方颗粒的主要特征成分进行多成分含量评价，以“指纹-含量”相结合的方式进行质控，将非常适合于中药配方颗粒的质量评价。

白芍为毛莨科芍药属植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根[6]，有养血调经，柔肝止痛，敛阴止汗，平抑肝阳的功效，广泛用于中药成方制剂中，如四物汤、桂枝汤、逍遥散等。现代药理研究表明白芍具有止痛、抗炎、保肝及多途径抑制自身免疫反应等多种药理作用[7-9]。白芍中的主要化学成分研究已有报道[10]，但目前对商品化白芍配方颗粒的质量控制研究报道较少，仅有对自制颗粒并多以芍药苷的含量为指标的质控方法[11-13]。单一指标无法反馈中医临床用药的整体疗效多成分、多靶点的特性，无法体现白芍配方颗粒的内在整体质量。因此，本研究采用HPLC-DAD法建立白芍配方颗粒的指纹图谱，并根据指纹图谱选择合适的定量指标对白芍配方颗粒进行多成分定量分析，为全面有效地评价白芍配方颗粒的质量控制提供实验依据。endprint

1 仪器与试药

安捷伦LC1290超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；DFY-500摇摆式高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；CPA225D型十万分之一分析天平（德国Sartorius公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HC-2068高速离心机（安徽中佳科学仪器有限公司）；甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯（德国Merck公司）；Milli-Q超纯水（美国Millipore公司）；其余试剂均为分析纯。

对照品没食子酸（批号：110736-201605）、芍药苷（批号：110736-201640）、儿茶素（批号：110877-201604）購于中国食品药品检定研究院，没食子酸甲酯（批号：MUST-15060162）、芍药内酯苷（批号：MUST-16080477）、苯甲酰芍药苷（批号：MUST-16100548）、五没食子酰葡萄糖（批号：MUST-16110737）购于成都曼思特生物科技有限公司，以上对照品经面积归一法测定，纯度均大于98%。样品：白芍配方颗粒10批，厂家及批号见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inetsil-ODS-SP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱程序：5%A→10%A（0～10 min）；10%A→15%A（10～23 min）；15%A→20%A（23～35 min）；20%A→25%A（35～45 min）；25%A→52%A（45～60 min）；52%A（60～68 min），流速为0.8 ml/min，柱温：30 ℃，进样量：10 μl。检测波长为233 nm、270 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 白芍配方颗粒供试品溶液 取10批次白芍配方颗粒研粉，过65目筛，分别取约0.2 g，精密称定，置50 ml容量瓶中，加40 ml 50%甲醇超声（功率：250 W，频率：80 kHz）处理30 min，冷却至室温，以50%甲醇定容，摇匀，静置，取一定量至EP管中，12 000 r/min离心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 混合对照品溶液 取没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷的对照品适量，精密称定，加入甲醇分别制备质量浓度为0.8975、0.3730、0.1260、2.4820、3.5030、1.4850、0.2057 mg/ml的单一对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液适量，置10 ml量瓶中，加入50%甲醇即得没食子酸179.5 μg/ml、儿茶素14.92 μg/ml、没食子酸甲酯5.04 μg/ml、芍药内酯苷496.4 μg/ml、芍药苷700.6 μg/ml、五没食子酰葡萄糖59.40 μg/ml、苯甲酰芍药苷41.14 μg/ml的混合对照品储备液。其他不同质量浓度的对照品混合溶液由混合对照品储备液逐级稀释获得。

2.3 指纹图谱研究方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密吸取同一份白芍配方颗粒供试品（G-7）10 μl连续进样6次，以芍药苷（10号峰）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间RSD和相对峰面积RSD均小于3.0%，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行评价，相似度均大于0.99，表明仪器精密度好。

2.3.2 重复性试验 同一批次白芍配方颗粒样品（G-7），照“2.2”项下供试品溶液制备方法平行制备配方颗粒供试品溶液各6份，以芍药苷（10号峰）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间RSD和相对峰面积RSD均小于3.0%，相似度均大于0.99，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液（G-7），按“2.1”项的色谱条件，分别在0、1、2、4、8、12、24 h进样10 μl，记录色谱图，以芍药苷（10号峰）为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，相似度均大于0.99，表明供试品溶液24 h内稳定。

2.4 白芍配方颗粒的指纹图谱建立

经过白芍配方颗粒样品DAD多波长的比较，选择将10批白芍配方颗粒在270 nm下的HPLC色谱图导入药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）软件中，设定G-1为参照图谱，进行色谱峰自动匹配，生成对照指纹图谱G-S，结果见图1。

2.4.1 共有峰的标定 经过10个批次白芍配方颗粒的色谱分析，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A）”在对照图谱上共生成20个共有峰，其中，对照图谱中10号色谱峰（芍药苷）分离度较好，色谱响应值较高，保留时间居中，因此选择10号峰为参照峰，同时采用对照品溶液加标法进行共有峰指认，标定其中7个共有峰，见图1。

2.4.2 白芍配方颗粒指纹图谱相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A）”，对10批次不同来源白芍颗粒的指纹图谱的检测数据进行处理，分析10批样品的相似度，结果见表2。由表2可知，各个批次白芍颗粒的相似度均在0.9以上，相似度良好。为了进一步比较各个批次间的含量差异，选择标定指认的7个共有峰（没食子酸、没食子酸甲酯、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷）进行含量测定研究。

2.5 白芍配方颗粒中7种主要成分含量测定

2.5.1 系统适用性试验 混合对照品和白芍配方颗粒供试品溶液，按照2.1的色谱条件分析，结果见图2。由图2可见，7种分析物：没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷分离度均大于1.5，理论塔板数均在10 000以上。endprint

2.5.2 线性范围考察 将2.2中制备的混合对照品，稀释成系列不同质量浓度的梯度对照品溶液，按2.1中的色谱条件依次注入液相色谱仪测定峰面积，以峰面积（Y）对化合物浓度（X）进行线性回归，求回归方程及线性相关系数（r）。并以化合物的响应为基线响应的10倍，信噪比：S/N=10作为定量限（LOQ），结果见表3。

2.5.3 精密度试验 取同一供试品溶液，按2.1的色谱条件1 d内连续进样6次，连续进样3 d，分别记录7种化合物的峰面积，计算峰面积的RSD，其日内精密度RSD范围在1.19%～2.19%，日间精密度的RSD范围在1.44%～2.46%，表明日内、日间精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取同一批次的白芍配方颗粒样品（G-7），按照2.2中供试品溶液制备方法制备白芍配方颗粒供试品溶液，常温下保存，按2.1的色谱条件分别在0、1、2、4、8、12、24 h进样10 μl，记录7种化合物峰面积并计算RSD，其范围在1.35%～2.39%，表明样品在24 h内稳定。

2.5.5 重复性试验 取同一批次白芍配方颗粒样品（G-7）6份，按照2.2中供试品溶液制备方法制备白芍配方颗粒供试品溶液，平行6份，按2.1中的色谱条件分别进样，测定峰面积，计算7种化合物的含量，其含量RSD范围在1.85%～2.62%，表明方法重复性良好。

2.5.6 回收率试验 取重复性实验同批白芍配方颗粒样品（G-7）

6份，0.1 g，按照近似1∶1量添加7种分析物对照品，加入样品中，按2.2进行样品制备，按2.1的色谱条件分别进样分析测定，计算平均回收率在96.0%～98.6%，RSD在1.39%～2.57%，表明方法回收率良好。

2.5.7 样品含量测定 精密吸取2.2中10批次白芍配方颗粒供试品溶液，按2.1的色谱条件进行測定，得到10批白芍配方颗粒7种主要成分的峰面积，以外标法计算含量，结果见表4。

3 讨论

3.1 供试品的制备

针对白芍配方颗粒所含化学成分，比较了不同浓度甲醇（10%、30%、50%、70%、90%、纯品）作为提取溶剂，当甲醇浓度低于50%时，可能由于样品淀粉、糊精等辅料影响导致样品黏度较大，而甲醇浓度大于70%时，色谱峰分离度较差，最终以50%（体积分数）甲醇作为提取溶剂。此外，实验还比较了回流提取法和超声提取法，两种方法无明显差异，故采用操作简单便捷的超声法。在此基础上，对超声提取法进行考察，包括提取的溶剂、次数、溶剂倍量、时间，最终选择50%甲醇超声提取1次，250倍量，提取30 min。

3.2 色谱条件的优化

实验通过比较Polar-RP C18（Welch 4.6 mm×250 mm，5 μm）、Luna C18（Phenomenex 4.6 mm×250 mm，5 μm）、X-selcect C18（Waters 4.6 mm×250 mm，5 μm）、Inertsil ODS-SP C18（Shimadzu 4.6 mm×250 mm，5 μm）四款色谱柱，结果表明，Inertsil ODS-SP色谱柱所得色谱图峰数较多，分离度好。流动相经过优化，确定以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相洗脱样品溶液，可获得平稳的基线，符合指纹图谱和含量测定研究的要求。

3.3 检测波长的选择

不同的化合物在不同波长下对紫外线吸收强度不同，因此检测波长的正确选择对于指纹图谱的构建及化合物的准确定量发挥着重要作用。本研究采用HPLC-DAD法，采集了210～400 nm波段的色谱图，通过比较不同波长下的色谱图，发现270 nm波长处的色谱峰数目较多，各色谱峰响应值较大，且分离较好，因此选择270 nm波长下的色谱图构建白芍配方颗粒指纹图谱。然而，对于主要成分的含量测定，芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷在233 nm有强紫外吸收，而没食子酸、没食子酸甲酯、五没食子酰葡萄糖在270 nm处紫外吸收较强，因此，以233 nm作为芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷的定量检测波长，以270 nm作为没食子酸、没食子酸甲酯、五没食子酰葡萄糖的定量检测波长。

3.4 指纹图谱分析

通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A版）》对指纹图谱的相关参数进行相似度计算，其中若相似度在0.90以上，则说明配方颗粒化学轮廓接近，相对稳定。本研究用此软件建立10个批次的白芍配方颗粒的指纹图谱，结果表明10批白芍配方颗粒的相似度均在0.900以上，说明各个批次白芍配方颗粒的样品指纹图谱上相对稳定。

3.5 白芍配方颗粒的含量结果

本研究对6个厂家10批次白芍配方颗粒的7种成分进行含量测定，从含量的平均值可看出白芍配方颗粒中含量相对较高的依次为芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、五没食子酰葡萄糖，而苯甲酰芍药苷、没食子酸甲酯、儿茶素含量相对较低。首先，芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷属于白芍的单萜苷类成分，是白芍功效的重要物质基础[14]，芍药苷同时也是2015版药典白芍饮片的指标性成分，在G-1、G-5、G-7、G-9、G-10批中含量均达到120 mg/g以上，而G-2、G-3、G-4、G-6、G-8批次在100 mg/g以下，由此可以看出不同厂家、不同批次的颗粒剂虽然指纹图谱上有相似即指纹轮廓相似，但是内在的共有化学成分的含量上存有较大的差异，可能由于不同的生产原料、不同的生产加工工艺等原因所致。其次，没食子酸、五没食子酰葡萄糖和没食子酸甲酯属于酚酸类成分，经过含量测定，没食子酸、五没食子酰葡萄糖含量均值均超过10 mg/g，现代药理研究表明白芍没食子酰糖类成分，如五没食子酰葡萄糖，有显著的抗炎、抗肿瘤、保肝及氧化损伤神经保护等多重作用[15]，应该作为白芍配方颗粒中质控指标之一。最后，本次含量测定也检测了白芍中黄酮类成分儿茶素，其在配方颗粒中的含量在0.575～2.537 mg/g，含量相对低于白芍单萜苷类和酚酸类。endprint

本实验建立了HPLC同时测定白芍配方颗粒中的7种成分（没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷）含量指纹图谱方法，以指纹和含量相结合，方法简便、全面、准确，可以为白芍配方颗粒整体质量控制提供新的方法。

参考文献

[1]李远辉，李慧婷，李延年，等.高品质中药配方颗粒与关键制造要素[J].中草药，2017，48（16）：3259-3266.

[2]李松林，宋景政，徐宏喜.中药配方颗粒研究浅析[J].中草药，2009，40（S1）：1-7.

[3]张水寒，梁雪娟，刘浩，等.中药标准煎液科学问题的探讨[J].中国中药杂志，42（17）：3275-3281.

[4]范世明，徐惠龙，谢心月，等.三叶青叶指纹图谱研究及8种酚类成分含量测定[J].中国中药杂志，2016，41（21）：3975-3981.

[5]周丽清，陈海滨.利胆片的HPLC指纹图谱研究[J].海峡药学，2017，29（8）：39-42.

[6]国家药典委员会编.中国药典.第一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：105.

[7]赵丹萍，张建军，贺成，等.基于代谢组学技术的白芍养血柔肝作用机制研究[J].中草药，2017，48（16）：3412-3418.

[8] Chang Y，Zhang L，Wang C，et al.Paeoniflorin inhibits function of synoviocytes pretreated by rIL-1α and regulates EP4 receptor expression[J].Journal of Ethnopharmacology，2011，137（3）：1275-1282.

[9]吴跃文.白芍在治疗痹痛中不同剂量的临床效果分析[J].海峡药学，2017，29（6）：177-179.

[10]周秋香，李友宾，蒋建勤.白芍的化学成分研究[J].海峽药学，2009，21（6）：92-94.

[11]叶娟，高文远，刘新桥，等.白芍配方颗粒制备工艺优化及质量控制[J].中国药房，2007，18（9）：660-662.

[12]库尔班江，卡斯木江，赛力曼.白芍配方颗粒中芍药苷的含量测定[J].喀什师范学院学报，2008，29（3）：38-40.

[13]李宗伟，秦斯民.葛根、白芍中药配方颗粒制备工艺及质量标准研究[J].亚太传统医药，2015，11（4）：30-31.

[14]刘杰，陈琳，范彩荣，等.基于HPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS的白芍和赤芍主要成分定性定量研究[J].中国中药杂志，2015，40（9）：1762-1770.

[15]刘杰，许文，李煌，等.UPLC-MS/MS法同时测定白芍饮片中10种成分[J].药物分析杂志，2015，35（4）：635-643.

（收稿日期：2017-08-22）endprint