肌原纤维小片化指数与人体死亡时间的相关性

申 立 ，袁瑞忠 ，卞 杰 ，贺 盟 ，赵子琴

（1.银川市公安局物证鉴定所，宁夏 银川 750001；2.崇明县公安局刑事侦查大队，上海 202150；3.上海健康医学院，上海 201318；4.复旦大学基础医学院法医学系，上海 200032）

死亡时间推断具有十分重要的实践应用价值，是法医学研究的热点，因其受多种因素影响且客观环境变化复杂，也是研究的难点。经典的死亡时间推断方法有通过死后尸斑变化、体液化学变化、直肠温度、昆虫学等途径。随着科学技术的发展，利用DNA和蛋白质降解规律来推断死亡时间的研究[1-4]也随之开展。肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）是食品科学中检测肉类尤其是牛肉嫩度的一项指标。本研究前期将其用于兔肌肉组织的检测以推断死亡时间，建立了成熟的实验方法，得到了良好的相关性[5]，但运用于鉴定实践的依据尚不充足。故本研究拟通过检测人体组织中MFI随时间的变化规律，探讨MFI在实际检案中的运用，为死亡时间推断提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

匀浆机（宁波新芝科技股份有限公司），TGL-16G低温离心机（上海安亭科学仪器厂），20目细胞筛网（上海实生细胞生物技术有限公司），752S紫外分光光度计（上海棱光技术有限公司）。

牛血清白蛋白标准品（10735094001，上海妍琦生物科技有限公司），双缩脲试剂（GL1492-QYG，北京百奥莱博科技有限公司），MFI裂解缓冲液（包含100 mmol/L氯化钾，20 mmol/L磷酸钾，1 mmol/L EDTA，1mmol/L 氯化镁，1mmol/L 叠氮化钠，pH=7.0）。

1.2 样本选取及分组

本研究共取得10例人体样本的骨骼肌供研究 （人体样本由复旦大学基础医学院病理学系提供，已知死亡时间或肌肉离体时间，均已取得家属知情同意）。人体样本年龄为（76.5±4.6）岁，男性3例，女性7例。每例均取右肱二头肌和右股四头肌，置于室温［（25±1）℃］下，分别在死后 0、4、8、12、24、36、48、60、72 h 取上述肌组织各0.5g。

1.3 蛋白提取

将上述肌组织投入匀浆机，加入5mL预冷的MFI裂解缓冲液匀浆1 min；匀浆后于4℃低温离心机中以3000×g离心15min，弃去上清液；加入20mL MFI裂解缓冲液，混匀后重复离心，弃去上清液；再加入5mL MFI裂解缓冲液后混匀，通过20目细胞筛网滤去结缔组织碎片，制成蛋白混悬液备用。

1.4 蛋白定量（双缩脲法）

称取牛血清白蛋白标准品50mg，溶于5mL去离子水，配制成10mg/mL的标准蛋白溶液。分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 的标准蛋白溶液，用去离子水补足到 1mL 配制成质量浓度为 0、2、4、6、8、10mg/mL蛋白溶液，然后加入4mL双缩脲试剂，充分混匀，常温下在暗室中静置30min。反应后应用紫外分光光度计测其在540 nm处的吸光度，以蛋白质量浓度为自变量（x），吸光度值为因变量（y），绘制标准曲线。

1.5 MFI值测定

待测的样品蛋白提取液各取0.25mL，加入0.75mL MFI裂解缓冲液稀释。采用双缩脲法测定溶液吸光度，根据标准曲线查得各样品蛋白浓度。依照所测的蛋白浓度，使用MFI裂解缓冲液将每份样品溶液稀释成0.5mg/mL。将稀释后的肌原纤维混悬液充分混匀后倒入比色杯，立即应用紫外分光光度计测量其在540nm处的吸光度。以每0.5mg/mL肌原纤维蛋白浓度的吸光度值乘以200来记录，乘积在20～150，该乘积即为 MFI值[5]。

1.6 统计学分析

对测得的MFI数据利用SPSS 17.0软件进行统计分析。对各个时间点测得的MFI进行正态性分析（one-sample Kolmogorov-Smirnov test）；各组间比较运用单因素方差分析（one-way ANOVA）。以死亡时间为自变量（x），MFI值为因变量（y），进行回归分析，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 死后不同时间点各骨骼肌样本的MFI值

人体死亡以后，随着时间的延长，各骨骼肌样本测得的MFI值逐渐升高（表1），表明肌原纤维不断降解并断裂成小片段。

表1 死后不同时间点右肱二头肌和右股四头肌的MFI值 （n=10，±s）

表1 死后不同时间点右肱二头肌和右股四头肌的MFI值 （n=10，±s）

注：各组数据符合正态分布（P＞0.05）；各组间数据两两比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）

时间点 右肱二头肌 右股四头肌0h 32.60±2.88 31.60±2.91 4h 45.70±2.41 47.70±2.83 8h 58.40±1.84 60.00±3.09 12h 71.40±2.27 74.10±2.56 24h 93.40±3.27 93.70±3.40 36h 106.80±3.49 110.70±4.57 48h 120.90±2.77 128.20±5.65 60h 130.00±2.62 136.90±6.40 72h 139.90±2.81 144.40±5.36

2.2 数据分析结果

右肱二头肌组织得到0～72 h的回归方程为y=46.574+1.439 x（r=0.969 5，P＜0.05）；考虑到检案实践中最有价值且关注较多的为12 h以内，抽取0～12 h的数据建立回归方程为y=32.660+3.227x（r=0.9879，P＜0.05）。

右股四头肌组织得到0～72 h的回归方程为y=47.216+1.524 x（r=0.966 4，P＜0.05）；0～12 h 的回归方程为 y=32.380+3.495x（r=0.9839，P＜0.05）。

3 讨 论

MFI是食品科学领域的一个概念[6]，代表肌原纤维蛋白的水解程度，是用来衡量牲畜屠宰并经过一段时间保存后其嫩度的一个指标[7]。机体死亡以后，组织中腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）逐渐耗尽，维持内质网高钙浓度的钙泵失去作用，导致内质网中Ca2+外泄，激活蛋白质水解酶，从而使得肌原纤维上连接Z盘与I带、A带的蛋白发生降解，原本完整的肌原纤维断裂成含不同数目肌节的小片，因此称为肌原纤维的小片化[8]。通过对MFI的测定，还可以判断肉类的成熟程度。相关研究[6]表明，在肉类贮藏成熟过程中，随着成熟时间的延长，MFI值逐步升高，而且在早期变化明显。本课题组前期[5]在家兔肌肉组织研究中发现，相同蛋白浓度的肌原纤维悬浊液在540 nm处具有不同的吸光度，并随死亡时间的延长而增加。因此我们考虑将MFI值引入人体组织死亡时间的推断。

前期研究[5]以家兔作为实验对象，发现在死亡后24h 内，MFI值同死亡时间相关性较强（r＝0.961）。 本研究结果显示，死后12h内MFI值升高较显著，此后趋于平缓，该结果与家兔的实验结果略有差异，可能是人与兔之间的种属差异造成的。本研究发现，MFI值变化从12h变平缓，各时间点的MFI实测值距拟合曲线预测值的变异度波动更大。两个位置的人体骨骼肌，无论是0～12h的线性回归方程，还是0～72h的线性回归方程，在本实验都得到了较好的线性相关性，其中0～12h的相关系数（r）更接近1，说明相关性更好。这也与文献报道[5]的用肌肉降解推断死亡时间在早期效果较好的结论相符合。因此，本研究方法用于死后早期（0～12h）的死亡时间推断更为精确。MFI值在死亡12h后变化较平缓，其可能的机制为：随着死亡时间的延长，酶活性不断减弱直至丧失，对肌原纤维的消解能力也迅速下降；另一方面，随时间延长，肌原纤维也不断降解，后期都已降解成小片段，达到一定程度后难以继续降解等。因此，后期MFI值变化不大。

在高坠、碎尸等案件中，往往不能获得完整的尸体，有时仅有残缺不全的骨骼或肌肉组织，使死亡时间推断工作面临较大困难。在利用肌肉组织推断死亡时间方面，学者们也尝试了多种方法：有学者[9]通过大鼠死后肌肉组织中微生物ATP降解速度来研究死亡时间，有学者[10]根据肌肉、软组织的生物力学性状推断死亡时间，也有基于食品科学领域肉类新鲜程度的检测原理，根据肌肉浸渍液在不同时段的电导率变化来研究死亡时间[11]。然而，上述研究均局限于动物实验，其结果与人体组织应用方面尚有一段距离。本实验将MFI值的检测运用于人体组织，并取得了满意的结果，为其在法医学实际检案工作中的运用提供了较为可靠的依据，丰富了法医学早期死亡时间推断的研究内容。

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