天然杀伤细胞在肿瘤免疫治疗中的研究进展

方广，黄韧

(1. 广东医科大学，广东湛江 524045； 2. 广东省实验动物监测所，广州 510663)

近年来，肿瘤治疗领域中，免疫治疗越来越受到重视，并且研究成果显著[1]。众所周知，免疫系统分为两种，特异性免疫和非特异性免疫，又可称为获得性免疫和固有免疫。目前研究主要针对特异性免疫中的后天获得性T细胞展开[2]，研究发现T细胞是主要的抗肿瘤效应细胞。除此之外，固有免疫也发挥着重要作用，尤其是天然杀伤细胞(natural killer cell， NK cell)具有强大的细胞毒性，在肿瘤先天免疫应答中发挥重要作用，可以杀死初始肿瘤细胞和减少肿瘤转移，释放影响固有和获得性免疫应答的可溶性因子[3-5]。由此可见，NK细胞不仅自身能发挥抗肿瘤作用，同时还可以联系固有免疫和获得性免疫。美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准了可促进T细胞浸润的抗PD-1和抗CTLA-4(anti-PD-1 and anti-CTLA-4)药物制剂，但有部分报道指出部分NK细胞中具有类似于T细胞的PD-1/PDL-1免疫逃避机制[6-7]。比如，霍奇金淋巴瘤中的NK细细[8]。这部分报道指出在免疫检查点阻滞疗法中，NK细胞是潜在的治疗靶点；并且，优于获得性免疫的是这部分固有免疫特性是先天获得的，不仅可以遗传，而且还可以同种异体间传递；在自身发挥杀瘤作用的同时还参与到获得性免疫的启动和调节。以上种种均表明了NK细胞在抗肿瘤的地位不可小觑。

1 NK细胞抗肿瘤研究进程

近期的一项报道指出在行为活跃程度较高的肺癌荷瘤小鼠中，肿瘤生长明显受到抑制，其可能的原因在于活跃程度较高的小鼠具有较高的NK细胞杀伤活性[9]。其实，对于NK细胞作为癌症先天效应物的潜力，可以通过将体外扩增和活化的NK细胞过继转移于免疫缺陷小鼠中进行研究。人NK细胞过继性免疫治疗的小鼠模型可显示NK介导对移植人类肿瘤的排斥反应，并且可进一步使用细胞因子如IL-2和IL-15大大提高了NK细胞量及其对肿瘤细胞的细胞毒性作用。这些最初在小鼠体内进行的研究为20世纪80年代开始的自体NK细胞输注治疗奠定了基础[10]。为了进一步确证NK细胞的作用，研究人员开始体外分析NK细胞对肿瘤细胞的毒性作用。主要采用检测NK细胞活性的间接方式，以及检测NK细胞释放物或死亡靶细胞内所吸收或保留物质的直接方式[11]。目前，这些体外实验已经证实NK细胞对不同肿瘤细胞存在不同程度的杀伤作用。如一项研究通过使用了具有单一杀伤细胞抑制性受体(killer cell inlaibitory receptors，KIR)特异性的NK细胞系作用于人类白细胞抗原I型(human leukocyte antigen class I，HLAI)，结果表明NK细胞可杀伤原发性急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)髓母细胞，这项研究不仅证明了NK细胞可以识别原发性AML原始细胞，还指示出KIR配体失配在肿瘤细胞杀伤中的有益作用[12]。此外，亦有报道指出NK细胞可以介导杀伤一定数量的新鲜分离的人类部分肿瘤细胞，包括胃癌，卵巢癌，结肠癌和肾细胞癌[13]，这部分文献提出了同种异体反应性NK细胞针对实体瘤的可能性。而在近几年的研究中，为了提高效率并减少副作用，研究人员往往采用的方式是针对肿瘤抗原，令NK细胞表达嵌合抗原受体。比如人源化小鼠中具靶向性NK细胞的临床前评估开展的B系急性淋巴细胞白血病的临床试验[14]。事实上，肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)正在成为实现肿瘤治愈的关键因素，因为目前的治疗方法可以消除肿瘤细胞的大部分，但耐药性CSC持续存在会导致肿瘤复发[15]。而应激诱导抗原的上调以及NK细胞的靶向非增殖细胞的能力表明NK细胞可以有效地消除CSC。比如在胰腺癌荷瘤NSG小鼠中的研究证明活化转移的NK细胞可以减少瘤内CSC的数量，进而抑制肿瘤生长[16-17]。

另一方面，通过建立小动物模型来研究免疫细胞和人类肿瘤之间复杂作用的研究已经非常普遍，这部分的研究亦证实了NK细胞的抗肿瘤作用。运用正常免疫活性小鼠品系作为人类肿瘤的宿主一般无法成瘤，这是因为它们对人类肿瘤细胞产生异种免疫应答，导致肿瘤移植失败。针对此种情况，当前已经开发了几种可用于异种肿瘤移植的免疫缺陷小鼠模型，并且因为它们可以提供动物中人类肿瘤的病理生理学信息而引起高度关注。第一种用于异种移植的免疫缺陷小鼠是T-细胞缺陷的无胸腺裸鼠(Foxn1)[18]，其缺点是因为具备完整的体液获得性免疫系统和高活性的小鼠NK细胞，基本丧失了人类正常或恶性造血细胞植入的资格[19]。继而研发了自发突变小鼠B.C17-SCID，其可以阻止T和B细胞的发育，与裸鼠相比可以更易于接受人类实体瘤植入[20- 21]。然而有报道指出该小鼠存在人骨髓细胞低植入现象[22]，认为其可能是因缺乏获得性免疫而产生一种补偿机制，从而增强了NK细胞的活性。所以需要更有效的模型。进一步将C.B17-scid小鼠的Prdkcscid突变基因导入NOD近交系品系中，所构建的NOD-scid小鼠减弱了宿主对肿瘤和造血系统异种移植物的排斥反应，并且在先天免疫中存在几种损伤[23]。尽管NOD-scid小鼠支持大量实体瘤和血液恶性肿瘤的生长，但由于剩余的NK细胞活性和其他残留的先天免疫功能，部分肿瘤仍无法植入或有效生长[24-25]。目前在NOD-scid小鼠基础上运用基因工程敲除白细胞介素2受体(IL2rg)γ链所构建的NOD-scid IL2Rgnull(NSG)，是迄今为止免疫缺陷程度最严重的小鼠。由于IL2rg敲除可阻断IL-15信号传导途径，导致缺乏功能性NK细胞，这是支持各种恶性肿瘤生长的关键特征[26]。

2 NK细胞的抗肿瘤机制

2.1 识别机制

“丧失自我”假说(“missing-self” hypothesis)：一开始是因为观察到NK细胞可以直接作用于主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex class I，MHCI)缺失的肿瘤[27]。后来在鼠和人体内实验证实NK细胞毒性与靶细胞上MHCI类分子表达缺失直接相关[28-29]。NK细胞可以通过KIR、C型凝集素超家族抑制性受体(CD94/NKG2A)和白细胞抑制性受体(leucocyte inhibitory receptors，LIR)来区分正常细胞和肿瘤细胞。NK细胞的这部分受体与正常细胞的MHCI类分子结合后可以抑制NK细胞的细胞毒性作用，防止了杀伤正常细胞。而在初生肿瘤中，肿瘤细胞通常会下调或失去MHCI类分子的表达[30]，进而被NK细胞所清除。同时在肿瘤环境中大量的细胞因子和趋化因子也可以激活NK细胞，进而发挥作用[31]。

2.2 杀瘤机制

NK细胞可以通过多种机制发挥细胞毒性作用，其中最重要的是抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)。在针对实体瘤和血液恶性肿瘤的许多单克隆抗体疗法中，ADCC发挥了重要的抗肿瘤作用。由NK细胞表达的Fc受体(FcγRIII或CD16)与肿瘤表面上的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合[32]，这一特性因无需预先致敏而有区别于获得性免疫细胞。研究表明ADCC参与调控免疫细胞网络和获得性免疫应答的多个过程[33]。当NK细胞与其靶细胞形成免疫突触时，便会通过穿孔素和颗粒酶介导的细胞凋亡[34-35]：NK细胞释放预形成的细胞质颗粒，其类似于分泌型溶酶体并含有穿孔素和颗粒酶。穿孔素可以破坏蛋白，穿透靶细胞的细胞膜，而属于丝氨酸蛋白酶家族的颗粒酶则可以触发细胞凋亡程序。激活后，NK细胞迅速极化颗粒并将微管组织中心重新定位到与靶细胞突触。颗粒膜随后与质膜融合，外化并释放细胞毒性颗粒内容物，引发靶细胞凋亡[36]。该细胞毒性途径有依赖于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体超家族成员在的靶细胞表达。诱导凋亡的主要是两种TNF受体，Fas(CD95)和TNF相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)。而在活化的NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)中表达Fas配体(FasL)和TRAIL分子，这些配体结合靶细胞上的死亡受体，通过半胱天冬酶启动酶促级联反应，导致凋亡[37-38]。此外，活化的NK细胞也产生干扰素IFN-γ可间接促成靶细胞死亡[39-40]。 原因在于IFN-γ是一种II型干扰素，可激活树突细胞和巨噬细胞，并对获得性免疫应答具有多效性作用[38]。IFN-γ有助于激活肿瘤微环境中的固有免疫和获得性免疫细胞，并产生持续的抗肿瘤免疫应答[41]。

3 靶向肿瘤的NK细胞治疗

3.1 临床NK细胞疗法方式

在将NK细胞输注进入患者体内之前，可以通过体外短期暴露将NK细胞激活。为了获得临床上足够量的NK细胞，需要它们在体外长期培养扩增。然而，体外培养扩增可能会导致潜在的表型发生变化，进而导致其选择性扩增，降低细胞毒性杀伤作用。但是，这部分担忧可以通过技术改进来消除，以获得具有体内抗肿瘤功效的临床相关NK细胞。以下几个因素影响NK细胞的临床效力：①NK细胞的来源：外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)、脐带血(umbilical cord blood，UCB)，细胞系，人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，HESC)诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cells， iPSCs)[42]；②用于刺激的细胞因子的类型；③细胞培养和条件的培养基，扩增等。

NK细胞的纯化可以采用在cGMP条件下的血清法或Ficoll分离处理PBMC以进行[43]。 Sukamoto等[44]采用了一种独特的方法，在没有事先纯化外周血的情况下产生大量NK细胞，即用自体血浆，IL-2，OK-432和γ-照射的自体T-细胞(FN-CH 296刺激)培养PBMC细胞。在第21～22天，NK细胞纯度达到90.96%。免疫磁性耗尽法是纯化和富集NK细胞的另一种方法，涉及耗尽其他淋巴细胞如T和B细胞和骨髓细胞[45]。Nguyen等[46]报道了造血干细胞(HSC)移植后部分T细胞耗竭的有益作用，从而表明T细胞在体内刺激NK细胞活性中具有积极作用。饲养层细胞和细胞系在NK细胞体内扩增中的应用也有报道[47]。此外，通过免疫磁性选择直接富集CD56+细胞是另一种有用的方法[45]。通过CD34+的分化和扩增从骨髓，外周血或UCB中使用HSC(CD34+)可以成为具有临床相关性抗肿瘤NK细胞的另一潜在来源。最近，一项研究表明，与新鲜CBCD34+和冷冻PBCD34+[48]相比，冷冻CBCD34+是产生NK细胞的最有希望的HSC来源。来源于UCB的NK细胞活性较低，表现出降低的杀伤特性，但可以通过用IL-2，IL-12和IL-15进行离体处理来刺激[45]。 Knorr 等[47]报道NK细胞的重要来源HESC和iPSC可降低免疫排斥反应的风险。在这个过程中，HESCs和iPSCs经历两阶段培养方法，通过SPIN-EB系统分化成CD34+细胞[49]。源自人类胚胎干细胞的NK细胞具有在体内和体外杀死多种类型的肿瘤的能力。来源于HESc和IPSC的NK细胞能够抑制来自CEM-GFP细胞的HIV-1 NL4-3感染[50]。此外，基于小鼠异种移植模型的研究还观察到来源于PB和iPSC的NK细胞具有介导杀死卵巢癌细胞的能力[51]。在无异种和无血清条件下，产生细胞毒性NK细胞，导致临床规模生产向前迈进一步[47]。

3.2 未来NK细胞疗法发展方向

对于现有的抗癌疗法，NK细胞的细胞系(NK-92，NKL，KYHG-1和NKG)是潜在的工具。此外，表达细胞内IL-2和细胞表面分子如CD16，NCR或嵌合抗原受体的基因修饰NK细胞系也被用作产生活化的NK细胞的可能工具[49]。这一思路来源于，近年来，FDA批准了几例CAR-T细胞疗法用于癌症治疗[52-53]。优于CAR-T细胞疗法的是CAR-NK细胞疗法，其可以无需预先致敏而以非特异性方式杀死靶细胞，且异体NK细胞缺乏引起移植物抗宿主反应(graft-versus-host disease，GVHD)的潜力[54]。许多基因修饰的NK细胞已被选为临床试验，但所有这些仍处于新生阶段，一些新的潜在策略还处于研究中。此外，为了应对肿瘤微环境，各种免疫抑制疗法也正在开发中。许多方法涉及通过单克隆抗体触发ADCC，其抗原结合片段(Fab)结合肿瘤细胞，并且恒定区(Fc)结合NK细胞表面上的CD16配体[55]。此外， Anti-CD20(Rituximab)，Anti-Her-2(Trastuzumab)，Anti-CD52(Alemtuzumab)和Anti-EGFR(Cetuximab)都是利用ADCC触发现象的单克隆抗体的几个例子[56]。

4 结语与展望

理想的NK细胞可成为安全的、已有的且易于产生足够量的过继性细胞治疗产品。目前许多团队正在探索从外周血单核细胞、脐带血和胚胎干细胞提取NK细胞的方法。为了增加NK细胞对肿瘤的毒性作用，有团队已经尝试了将以NK细胞为基础的免疫疗法与各种有效细胞因子相组合，运用CAR转导和基因编辑的方法改变它们的抗原特异性，提高NK细胞在传输过程的持续性和提高其细胞毒性。对于NK细胞在肿瘤治疗中的实际应用，有必要深入了解其基础生理学，以便良好控制NK细胞活性。平行于临床上NK细胞库的开发，同时也需要进行比较性临床试验。未来需要进行基于NK细胞产品的多中心临床试验，以评估其数据的有效性。很快，NK细胞治疗可能会成为治疗人类癌症的最有前景的工具之一。