猪致病性大肠杆菌的分离及中药药敏试验

徐东方，韩 露

（1.河南省获嘉县乡镇动物防疫检疫中心站，河南 获嘉 453800；2.河南省畜牧总站）

大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的多种动物和人的一组肠道性共患传染病，是目前养猪业最常见和危害性最大的细菌性疾病之一。它结构比较简单，容易培养，繁殖能力强，被公认为生物学上重要的实验材料。由于该病对仔猪危害较大，因此找出最有效的防治方法特别重要，猪大肠杆菌病的传统治疗多用抗生素，但是由于用药的不规范从而导致部分大肠杆菌对抗生素产生耐药性。中药治疗该疾病愈来愈受到重视，所以该文对猪致病性大肠杆菌的分离及中药药敏进行了试验，试验结果表明，中药治疗及预防仔猪大肠杆菌病具有重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基及实验仪器

营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红美兰琼脂、普通营养琼脂培养基；无菌操作台，立式高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱。

1.1.2 试剂及实验动物

大肠杆菌因子，生化试剂以及其他相关用品均购自上海市医学化验所试剂厂；实验所需小白鼠由新乡医学院实验中心提供。

1.1.3 病料

来自河南省辉县、获嘉县等地的大中型猪场中具有很明显腹泻症状的或者具有黄白痢症状的仔猪，用直肠棉拭子蘸取少量的排泄物混悬于装有1ml营养肉汤的试管中。

1.1.4 受试中药

大黄、甘草、黄连、胡黄连、元胡、黄薄荷、当归、杏仁、首乌、独活、泽泻、苍术、丹参、麻黄、栀子、柴胡、枳实等31种中药。

1.1.5 生化试剂

蔗糖、山梨醇、硫化氢、V-P试剂、尿素、MR试剂、蛋白胨水、枸橼酸盐、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、糖类发酵管等均按常规方法制备。

1.2 试验方法

1.2.1 病猪剖检及病料采集

对病猪进行剖检：患病的仔猪具有急性卡他性肠炎症状，肠道肿胀，胃内有凝乳块，肠系膜淋巴结水肿，充血，有弥漫性针尖状出血。剖开可见肠道内充满黄绿色液体内容物和气泡或充满灰白色酱糊状内容物和气泡，散发腥臭味。个别病猪肝脏、肾脏出现小的坏死灶。无菌条件下用直肠棉拭子蘸取少量的病猪的排泄物混悬于盛有10 ml普通营养肉汤的试管中，备用。

1.2.2 病原菌的分离培养与纯化

将采集的病料涂片，革兰氏染色，镜检。同时无菌操作将可疑病料接种在伊红美蓝培养基、麦康凯培养基及普通营养培养基上，37℃下恒温培养24 h后观察细菌生长及菌落特征。以无菌操作挑单个典型菌落的一半划线接种于伊红美蓝培养基与麦康凯培养基上37℃下恒温培养24 h，将另一半菌落涂片，革兰氏染色，镜检;细菌的纯化：取初步分离的细菌，在普通培养基上画线接种后，在37℃下恒温培养一天，获得的纯培养物放在4℃的低温环境中保存备用。

1.2.3 生化试验鉴定

用灭菌环挑取麦康凯琼脂平板上的形态特征明显的红色单菌落，做细菌的微量生化实验。

1.2.4 致病性试验

将分离纯化后的大肠杆菌，接种于普通肉汤培养物中，摇床37℃培养24 h作为致病性试验菌液。①注射菌数：每只小白鼠注射0.5 ml。②注射方法：取各种生理标准相似的健康小白鼠15只，分别进行腹腔注射，24 h以后观察发病情况，剖开观察病变后进行细菌分离。

1.2.5 细菌的扩大培养

在无菌工作台中用灭菌的接种环挑取麦康凯琼脂培养基上单个的粉红色菌落接种于多个普通琼脂培养基上，涂满整个平皿，然后恒温培养24 h。划线培养，须涂满整个平板，随后进行药敏试验。

1.2.6 中药的煎制

将黄芩、黄连等31种中药分别按照20 g：200 ml的比例煎药，每份中药重20 g，用凉水煎，在水沸前加入药物，先用大火煮煎到水沸，水沸后再用小火继续煎45 min。煎制好的药液要求每毫升含药物量为1 g，取煎好的药液用四层纱布过滤装入灭菌的玻璃瓶（20 ml）中，瓶口压线，再次高压蒸汽灭菌，晾凉后备用。

1.2.7 中药药敏片的制备

用打孔器将滤纸片制成小圆片（直径约6 mm），用报纸包好，高压蒸汽锅121℃消毒0.5 h。将灭菌滤纸片放入事先准备好的中药药液中浸泡45 min，备用。

1.2.8 中药药敏试验方法

将制好的药敏片无菌贴在涂满细菌的普通营养琼脂培养基表面上，每个平皿上按照标准放入四片，纸片间的距离要适当，方便观察。37℃恒温培养24 h，观察结果。

1.2.9 药敏试验结果判定

对药的敏感性通过抑菌圈的大小来判断。根据参考文献上的标准，抑菌圈直径越大表明该药的敏感性越高。凡是抑菌圈直径≥10 mm者为强抑菌（敏感），用+++表示；抑菌圈直径为8～9 mm者为抑菌（中敏），用++表示；抑菌圈直径≤6 mm者为弱抑菌（耐药）。

2 结果与分析

2.1 细菌菌落与细菌形态

在麦康凯琼脂平板上形成了边缘整齐、直径2～3 nm中央凹陷、中等大小的粉红色菌落；伊红美蓝琼脂平板上形成深紫色、隆凸、表面湿润、有黑色金属光泽，直径约1.5～2.5 nm的菌落。普通培养基中光滑、湿润、半透明、外观呈圆形有凸起、颜色灰白的菌落。

2.2 生化试验鉴定结果与分析

细菌生化试验结果可得所培养的细菌生化实验能发酵乳糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、葡萄糖、产酸产气，多数不发酵蔗糖或者少数延迟发酵蔗糖、三糖铁底部产酸、MR试验阳性、VP试验阴性、产生靛基质、尿素酶试验阴性，实验结果显示的特征符合大肠杆菌的特点。

2.3 致病性实验结果与分析

将分离纯化培养的细菌，接种到试验用小白鼠体内，对24 h后出现病理症状的小白鼠进行剖检，分离病料采集细菌。可得知细菌染色形态，生化特征，以及病理变化与接种菌一致，说明接种的大肠杆菌具有致病性。

2.4 药敏试验结果与分析

通过药敏试验得出，大肠杆菌对薄荷、朱砂、黄连、防风、地榆、王不留敏感；对杏仁、首乌、独活、石膏、栀子、柴胡、枳实、丹参、麻黄、大黄等中度敏感；对甘草、黄精、连翘、牛膝、胡黄连、元胡、黄党参、莱菔子、黄芩有一定的耐药性。

3 讨论

从上面的实验结果，可以找到几种对仔猪大肠杆菌具有特效的中药。下面对这几种高效药物的作用，进行详细的表述：①黄连：清热燥湿，泻火解毒。黄连内含小蘖碱，它具有广谱抗菌性，对多种杆菌、球菌、真菌、病毒等都有较强的抑制作用。特别是对菌痢、腹泻、胃肠炎等症效果极好。小蘖碱具有良好的消炎、利胆、扩张血管和降低血压的作用，并且还能增强机体的抵抗力。用于湿热内蕴、胃肠湿热、泻痢等症，和木香、黄芩等一起合用以治泻痢。②朱砂：朱砂可以安神，明目，解毒。主要成分为硫化汞，但常夹杂雄黄，沥青质等有解毒防腐作用。外用能抑制或杀灭皮肤细菌和寄生虫。清热解毒效果好，内服、外用均可。③薄荷：俗名“银丹草”，是中国常用中药之一。它的活性成分为薄荷油。薄荷油中主要成分为I-薄荷醇、1-薄荷酮及薄荷酯类等。薄荷油是一种常用的药物。它不仅能促进呼吸道腺体分泌，而且对呼吸道炎症有治疗作用。试验研究表明，薄荷煎剂对单纯性疱疹病毒、流行性腮腺炎病毒有抑制作用，而且对肠炎球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌等有很好的抑菌作用。

中草药在防治大肠杆菌病方面的特点和优势与化学药物和抗生素相比表现出极大的优势。化学药物和抗生素耐药谱广，具有毒副作用，甚至能通过肉、蛋传给人类，中草药克服了这一难题。可见中草药可以为人类健康带来很大的保障。

4 小结

通过对疑似患有大肠杆菌病的仔猪进行临床观察，剖检，并进行实验室检查，确定患病仔猪患有大肠杆菌病，并从病料中分离到致病性大肠杆菌，对分离到的细菌进行药敏试验，试验结果表明，黄连对大肠杆菌具有良好的抑菌效果，因此选用黄连作为治疗仔猪大肠杆菌病的首选药物。由于抗生素在治疗和预防用药中容易产生耐药性，而中药可以避免机体产生耐药性，因此选用中药治疗及预防仔猪大肠杆菌病具有重要意义。□