不可逆电穿孔消融同种异体肌腱移植对兔肌腱缺损修复的实验研究*

康云 王永强 宋越 雷军玲

(1.陕西省荣誉军人康复医院外二科，陕西 华阴 714200；2.中国人民解放军第二0二医院 妇产科/泌尿外科，辽宁 沈阳 110000)

临床上肌腱损伤较常见，其中肌腱缺损约占手部肌腱损伤的1/4[1]。肌腱移植在手足重建外科中应用广泛，可用于修复肌腱缺损、恢复关节稳定性。单条肌腱缺损修复可考虑自体肌腱移植[1-2]，但多条或多段肌腱缺损的修复仍是临床面临的棘手问题。目前临床上常见的各种肌腱移植修复方式均存在一定的缺陷：自体肌腱由于来源有限，取材后影响肢体的外观与功能；人工肌腱存在材料与受体肌腱愈合困难等问题尚未解决，临床推广缓慢[2]；同种异体肌腱存在免疫排斥反应、组织再血管化缓慢等不足[4]，但因其来源相对充足、取材方便，可避免损伤患者肢体结构与功能等优点，已成为修复该类肌腱缺损较理想方法。目前国际上对于同种异体肌腱移植前预处理方法普遍接受的是程序性深低温冷冻法。但由于深低温法易在腱细胞内外形成冰晶，破坏了腱细胞的生物活性，且不可避免的对细胞外基质等水合性纤维网络凝胶结构造成损伤，术后存在诸如宿主免疫排斥反应重、腱细胞爬行替代缓慢、远期力学强度欠佳、外源性愈合易形成粘连等问题，远期修复效果不理想[3]。

不可逆电穿孔消融法(irreversible electroporation，IRE)是一种近年来发展起来的的新型组织灭活方法，IRE原理是在特定电场强度作用下，细胞膜上出现永久性纳米级微孔，细胞因内环境稳态破坏而死亡[5]。我们既往使用IRE技术原位灭活兔跟腱，确认胶原纤维组成的肌腱框架组织可以完整保留，消融术后12周时肌腱的组织形态及生物力学性能可以恢复至正常对照水平[6]。本实验拟采用IRE技术消融对同种异体肌腱移植修复兔肌腱损伤，探讨IRE灭活的同种异体肌腱移植修复肌腱缺损的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器 6月龄雄性新西兰大白兔112只，体重(2.5 ± 0.5)kg，由第四军医大学实验动物中心提供；Microfil硅胶灌注液(Flow Tech公司，美国)；手持式平行板电极夹(BTX公司，美国)；游标卡尺(精确度0.02 mm；上海量具刃具厂有限公司)；Instron-3300万能试验机(Instron公司，美国)。

1.2 分组及实验方法

1.2.1 分组 112只兔随机分为3个实验组和1个对照组，自体肌腱移植组(A组)28只，深低温冷冻同种异体肌腱移植组(B组)28只，IRE灭活同种异体肌腱移植组(C组)28只和假手术对照组(D组)28只。

1.2.2 方法 A组：肌肉注射陆眠宁(0.1 mL/kg)麻醉动物后，于双后肢第3足趾鞘管区作纵切口显露屈趾肌腱，分别切断长约2 cm的第3趾深屈肌腱，使用5～0丝线，采用改良Kessler法及外周缝合法将切取的肌腱左右互换后行端端缝合并加固。B组：麻醉、取材及缝合方法同A组，取动物左后肢相同部位肌腱，关闭切口，使用丝线标记肌腱后以冷冻保护剂浸泡2 小时，然后置于-80 ℃冰箱内2周；2周后取肌腱室温复温，按A组方法于动物右后肢第3趾深屈肌腱制备长约2 cm缺损，根据标记随机选取非自体肌腱进行移植。C组：麻醉后显露右后肢第3趾深屈肌腱，采用手持式平行板电极夹持肌腱，经游标卡尺测量确保两平板电极间距离为3 mm。IRE消融采用连续10个电场强度1 800 V/cm、波长100 μs、间隔100 ms的电脉冲为1组输出，共输出9组脉冲[6-7]。消融参数预先设置，消融全程采用电脑控制，示波器监视脉冲输出的电压、波长、间隔、数量等是否符合预设值。消融全程观察两电极间是否有渗血，发现渗血及时清除，避免短路。消融完成后将消融段肌腱完整切断备用，关闭右后肢切口，按A组方法于动物左后肢第3趾深屈肌腱制备长约2 cm缺损，根据标记随机选取非自体肌腱进行移植，缝合方法同A组。D组：动物麻醉后仅显露右后肢第3趾深屈肌腱，不做任何其他处理，同上法缝合关闭切口。

术后所有动物回笼饲养，患肢自由负重。术后3 天每日给予美洛昔康2 mg/kg，1/8小时肌注以缓解疼痛。术后1、4、8、12周，各组分别取7只动物，其中2只麻醉后行微血管灌注，其余动物耳缘静脉推注20 mL 10 %氯化钾处死，靶肌腱先行大体观察，再取其中2条进行组织学观察，余3条进行生物力学测试。

1.3 观测指标

1.3.1 微血管灌注观察 动物麻醉后，腹主动脉插管灌注Microfil硅胶灌注液，取灌注后的肌腱，大体观察移植肌腱有无断裂，是否水肿等。然后将其平均分为4等份，游标卡尺测量3个分割点处肌腱直径，取均值。0周数据为各组处理前测量结果。灌注肌腱经冷冻、脱水、透明、石蜡包埋，6 μm切片，伊红染色，使用Image Pro Plus 11.0软件测量移植肌腱微血管有效灌注面积(6)。

1.3.2 组织学观察 4 %多聚甲醛固定肌腱，经脱水、透明、浸蜡，切片，常规HE染色，镜下观察。

1.3.3 生物力学测试 取第3趾深屈肌腱全长，两端分别固定于冷冻夹具中，肌腱均未预先行周期性拉伸。维持室温25 ℃，给予0.5 N拉力，测试机两端以10 mm/s相对速度分离，直至肌腱断裂，电脑自动描记载荷-位移曲线。肌腱断裂时的载荷及位移即为最大载荷及破损形变，计算硬度(最大载荷/破损形变)。

2 结果

2.1 移植肌腱及微血管灌注观察 实验期间，各组动物均无死亡，手术切口愈合良好，切口无红肿、渗出及裂开，各组肌腱均未发生断裂，(见图1)术后1周，A、B、C组移植肌腱无明显水肿；术后4周，A、B、C组移植肌腱均存在轻微水肿；术后8周，B组移植肌腱轻微水肿，A、C组情况与D组无显著性差异；术后12周，A、B、C组大体观察与D组无明显差别。综合结果，A、B、C、D组在各时间点肌腱直径差异无统计学意义(P> 0.05)，见表1。

术后1周，A、B、C组微血管有效灌注面积显著低于D组，比较差异有统计学意义(P< 0.05)；A、B、C组间比较差异无统计学意义(P> 0.05)。4周时，B组显著低于A、C、D组，差异有统计学意义(P< 0.05)，A、C、D组间比较差异无统计学意义(P> 0.05)。8周时，B组显著低于A、C、D组，差异有统计学意义(P< 0.05)；A、C组显著高于D组，比较差异有统计学意义(P< 0.05)，A、C组间比较差异无统计学意义；12周时，B组显著低于A、C、D组，差异有统计学意义(P< 0.05)，A、C、D组间比较差异无统计学意义(P> 0.05)，见图2。

图1术后各时间点各组实验兔肌腱大体观察
Figure1Grossobservationoftendonsineachtimepointineachgroup

表1 各组实验兔移植肌腱直径比较Table 1 Comparison of diameter of transplanting tendon

图 2 各时间点各组实验兔肌腱微血管有效灌注面积比较。

Figure2Comparisonofmicrovasculareffectiveperfusionareaateachtimepoint.

2.2 各组实验兔组织学观察 D组肌腱胶原纤维呈波浪状，与肌腱长轴平行，肌腱细胞核呈扁梭形，均匀散在分布于胶原纤维间隙内。术后1周，A、B、C组肌腱细胞均消失；术后4周，与B组比较，A、C组标本中可见较多成纤维细胞核散在分布于胶原纤维中间，肌腱外膜增厚，微血管开始长入；术后8周，A、C组可见成纤维细胞大量增殖，聚集在新生毛细血管周围，胶原纤维之间成纤维细胞继续增加；而B组肌腱内成纤维细胞数量较前增加不明显；术后12周，A、C组肌腱胶原纤维排列较整齐，成纤维细胞在胶原纤维间出现局灶性聚集，B组较8周时无明显变化，见图3。

2.3 各组实验兔生物力学测试 术后4周时肌腱最大载荷B、D组间比较，差异有统计学意义(P< 0.05)；术后1、8、12周时，各组最大载荷比较，差异均无统计学意义(P> 0.05)。各时间点各组移植肌腱破损形变比较，差异均无统计学意义(P> 0.05)。术后1、4、12周时，各组肌腱硬度比较，差异均无统计学意义(P> 0.05)；术后8周时B、D组间比较，差异有统计学意义(P< 0.05)，见表2～4。

图3 术后各时间点各组实验兔肌腱组织学观察(标尺=50 μm) Figure 3 Histological observation of tendon in each time point

分组n术后各时间点移植肌腱最大载荷(N)1周4周8周12周A组3341±52336±42329±40319±41B组3331±46215±38①251±29276±34C组3359±56360±45316±52298±31D组3329±27311±32331±76325±48F0．8597．7101．5660．973P0．5010．0100．2720．452

注：与D组比较，①P< 0.05

表3 各时间点实验兔移植肌腱破损形变比较Table 3 Comparison of damage deformation at each time point

表4 各时间点实验兔移植肌腱硬度比较Table 4 Comparison of hardness at each time point

注：与D组比较，①P< 0.05

3 讨论

全世界范围内每年有超过3000万的肌腱损伤患者。肌腱或韧带组织由于血供和细胞密度小(5 %)，再生能力弱，组织修复后形成的纤维瘢痕中含有大量Ⅲ型胶原纤维，因其组织结构松散、力学性能差，故易发生粘连，常常导致关节疼痛和功能障碍，严重影响患者的日常生活和工作。临床上经常会面对大段肌腱缺损需要移植的情况，理想的移植肌腱的特点应该是：①直径和长度足够，获取容易。②与替代的肌腱具有相似的生物学特性。③可以保留或提供新的血运。④不存在炎症及免疫排斥反应。⑤有足够的力学强度。对于大段肌腱缺损的患者，目前移植物选材主要包括自体肌腱、同种异体肌腱、人工肌腱和组织工程化肌腱等。

对比之下，同种异体肌腱移植的优势在于：①来源丰富、取材方便。②对宿主正常组织结构和功能无损伤。③保持肌腱原有生物结构特性。④手术时间短。近几年来，同种异体肌腱作为自体肌腱的替代品，经实验和临床研究证实安全有效，其主要应用包括：跟腱、手部肌腱、肩锁关节韧带及前交叉韧带损伤等的修复重建。目前国际上对于同种异体肌腱移植前预处理方法普遍接受的是程序性深低温冷冻法(深低温冰箱-70 ℃至-80 ℃，液氮-196 ℃)。但由于深低温法易在腱细胞内外形成冰晶，破坏了腱细胞的生物活性，且不可避免的对细胞外基质等水合性纤维网络凝胶结构造成损伤，术后存在诸如宿主免疫排斥反应重、腱细胞爬行替代缓慢、远期力学强度欠佳、外源性愈合形成粘连等问题，远期修复效果不理想。

IRE是一种新型、快速、精准的组织消融方法，由于破坏了细胞膜的完整性，不影响胶原纤维网络，因此能够在有效消融的基础上保留肌腱的基本框架结构[7]，这使得灭活区域肌腱组织存在再生的可能。一切热灭活方法通常因为灭活范围随温度升高以及灭活时间的延长而不断增加，造成灭活范围控制困难；而IRE可以设定一个准确的灭活范围，然后对组织实施精确灭活。对于一个细胞来讲，使用电穿孔后的结果是全或无的，也就是细胞或者可以生存，或者发生死亡。更重要的是，IRE仅对活细胞膜发生作用，而不损伤其他的组织结构。IRE不会引起蛋白质变性，而这一变化正是许多热灭活方法常无法避免的。另外IRE不受周边大血管血流的影响，IRE不损伤大血管和胆管系统，由于对供血系统的保留，并快速激活了免疫系统，灭活组织的再生速度快，组织疤痕修复概率小。

基于IRE独特的技术优势：IRE灭活范围内重要的组织结构不发生毁损、灭活时程短、灭活边界清晰、灭活全程可以实时监控、IRE引发细胞凋亡、不受“冷库效应”及“热库效应”的影响等。本实验使用IRE消融的同种异体肌腱移植修复肌腱缺损，结果显示，由于相对不产热，IRE未对肌腱的胶原纤维网络结构造成损伤，故术后无肌腱断裂发生；同时，由于消融全程非热源依赖，IRE消融移植组肌腱无论在组织形态、微血管数量及生物力学性能恢复等方面均与自体肌腱移植组无显著性差异；IRE消融移植组肌腱在术后通过肌腱母细胞爬行替代、腱包膜和腱内膜的再生以及向肌腱纤维束向内部长入、腱束内微血管再生、胶原原纤维的重塑及力学性能恢复等一系列方式完成重建修复。

肌腱整体的生物力学性能改变是客观评价肌腱功能恢复的重要指标。组织学分析表明胶原原纤维在IRE后经历了三个状态，分别是外观上未见明显损伤、胶原原纤维直径变细并且间隙增大、胶原塑形修复三个相互之间部分重叠的过程，因此胶原纤维生物力学性能也势必会随组合结构变化而发生改变。同种异体肌腱和自体肌腱一样，在移植术后都需要经过一个愈合过程，包括吻合口的连接、肌腱的再血管化、胶原原纤维的再生和应力塑形等[8,14-16]。传统深低温冷冻法预处理的异体肌腱由于冰晶对肌腱的影响，其在组织形态学和生物力学的恢复方面与自体肌腱尚存在一定的差距。我们既往使用兔模型证实了IRE消融的自体跟腱在术后第4周时已开始再血管化，至第12周时跟腱组织形态和生物力学性能与正常跟腱已无显著性差异(3)；我们还发现位于IRE消融边缘处的腱母细胞和位于腱内膜处的腱母细胞向消融区域爬行替代完成了组织再生修复过程，这些爬行替代的细胞可能是IRE消融区段腱母细胞的一个重要来源。本实验中，术后1周时肌腱内微血运完全中断，考虑为微血管内皮细胞死亡造成管腔闭塞，但由于胶原纤维网络的保留，微血管的修复和再生可以快速完成，并最终在数量上达到了正常肌腱生理代谢所需的水平[10-13]。在本实验全部观察时间段中，深低温处理的同种异体腱与自体移植腱及IRE消融的同种异体腱相比，其成纤维细胞再生、微血管再生及新生胶原纤维的塑形改建过程均明显延迟；深低温组肌腱再血管化迟滞，而合成的新生胶原纤维由于排列欠规则，由此其生物力学性能在移植术后的一段时间内发生减损是可以解释的[17-19]；而IRE消融组肌腱在整个实验观测过程中由于胶原纤维的连续性得以保留，无胶原原纤维的微破裂发生，因此肌腱强度在术后保持相对平稳，这些组织框架结构的完整保留有利于肌腱细胞术后早期的爬行替代和微血管快速再生修复[20-21]。

本实验尚存在的不足：①样本量较小，仅为单中心实验数据，IRE技术的应用尚需要在多种大、中型动物体内获得更多实验数据的支持。②观察时间较短。③虽然既往研究证实IRE可以在有效消融组织细胞的同时不引起特定的细胞免疫反应[11]，但是不除外消融的腱细胞碎片被吞噬清除的过程包含着部分免疫应答，我们的实验仅观察了消融术后异体肌腱移植的短期临床效果。④IRE技术的开展应用目前尚需要充足的设备资源，本实验没有采用小型、轻量化的电穿孔设备进行实验，研究步骤和方案有待进一步精简。总之，IRE能否用于包括肌腱、韧带在内的结缔组织尚是一个有待深入探索的问题。按照既往的研究结果分析推理，IRE有望克服传统热灭活的部分弊端，但同时由于IRE自身存在很多技术上的限制，包括脉冲设备的组建、电压安全性的要求、个体化病人的适应性、生物组织的多样性和不均一性等等，这些都阻碍了IRE的应用。

4 结论

采用IRE灭活的同种异体肌腱修复兔肌腱缺损切实可行，术后移植肌腱组织形态及生物力学性能恢复与自体肌腱移植组无显著差异。

[1]Huang H, Zhang J, Sun K,etal. Effects of repetitive multiple freeze-thaw cycles on the biomechanical properties of human flexor digitorumsuperficialis and flexor pollicis longus tendons[J]. Clin Biomech (Bristol, Avon), 2011, 26(4): 419-423.

[2]Oryan A, Moshiri A, Meimandi-Parizi A. Implantation of a novel tissue-engineered graft in a large tendon defect initiated inflammation, accelerated fibroplasia and improved remodeling of the new Achilles tendon: a comprehensive detailed study with new insights[J]. Cell Tissue Res, 2014, 355(1): 59-80.

[3]Marx RE, Cillo JE Jr, Broumand V,etal. Outcome analysis of mandibular condylar replacements in tumor and trauma reconstruction: a prospective analysis of 131 cases with long-term follow-up[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2008, 66(12): 2515-2523.

[4]Lange-Consiglio A, Tassan S, Corradetti B,etal. Investigating the efficacy of amnion-derived compared with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in equine tendon and ligament injuries[J]. Cytotherapy, 2013, 15(8): 1011-1020.

[5]Wagstaff PG, Buijs M, van den Bos W,etal. Irreversible electroporation: state of the art[J]. Onco Targets Ther, 2016, 9: 2437-2446.

[6]Song Y, Zheng J, Yan M,etal. The effects of irreversible electroporation on the Achilles tendon: an experimental study in a rabbit model[J]. PLoS One, 2015, 10(6): 0131404.

[7]Song Y, Zheng J, Yan M,etal. The effect of irreversible electroporation on the femur: experimental study in a rabbit model[J]. Sci Rep, 2015, 5: 18187.

[8]Bernstein DT, Harris JD, Cosculluela PE,etal. Acute tibialis posterior tendon rupture with pronation-type ankle fractures[J]. Orthopedics, 2016, 39(5): 970-975.

[9]Lyras DN, Kazakos K, Tilkeridis K,etal. Temporal and spatial expression of TGF-b1 in the early phase of patellar tendon healing after application of platelet rich plasma[J]. Arch Bone Jt Surg, 2016, 4(2): 156-160.

[10] Quarto R, Giannoni P. Bone tissue engineering: Past-Present-Future[J]. Methods Mol Biol, 2016, 1416: 21-33.

[11] Al-Sakere, B. Bernat C, Andre F,etal. A study of the immunological response to tumor ablation with irreversible electroporation[J]. Technol Cancer Res Treat, 2007, 6(4): 301-306.

[12] Kwon JY, Gonzalez T, Riedel MD,etal. Proximity of the lateral calcaneal artery with a modified extensile lateral approach compared to standard extensile approach[J]. Foot Ankle Int, 2016. (Epub ahead of print)

[13] Skedros JG, Kiser CJ, Hill BB. Florid suprascapular neuropathy after primary rotator cuff repair attributed to suprascapular notch constriction in the setting of double crush syndrome[J]. J Brachial Plex Peripher Nerve Inj, 2015, 10(1): 66-73.

[14] Capogna B, Strauss E, Konda S,etal. Distal patellar tendon avulsion in association with high-energy knee trauma: A case series and review of the literature[J]. Knee, 2016. (Epub ahead of print)

[15] Salvesen ES, Holen KJ. The value of visa-score and colour flow imaging in the follow-up of non-athletes operated for jumpers knee[J]. J Sports Sci Med, 2016, 15(4): 633-638.

[16] Palmanovich E, Shabat S, Brin YS,etal. Novel reconstruction technique for an isolated plantar calcaneonavicular (SPRING) ligament tear: A 5 case series report[J]. Foot (Edinb), 2016, 30: 1-4.

[17] Noyes FR. Editorial commentary: lateral extra-articular reconstructions with anterior cruciate ligament surgery: are these operative procedures supported by in vitro biomechanical studies[J]. Arthroscopy, 2016, 32(12): 2612-2615.

[18] Gibson PD, Sobol GL, Ahmed IH. Zone II flexor tendon repairs in the United States: Trends in current management[J]. J Hand Surg (Am), 2016. (Epub ahead of print)

[19] Gandhi MJ, Knight TP, Ratcliffe PJ. Scapholunate ligament reconstruction using the palmaris longus tendon and suture anchor fixation in chronic scapholunate instability[J]. Indian J Orthop, 2016, 50(6): 616-621.

[20] King EA, Lien JR. Flexor tendon pulley injuries in rock climbers[J]. Hand Clin, 2017, 33(1): 141-148.

[21] Khor WS, Langer MF, Wong R,etal. Improving outcomes in tendon repair: A critical look at the evidence for flexor tendon repair and rehabilitation[J]. Plast Reconstr Surg, 2016, 138(6): 1045-1058.