黄鳝和泥鳅感染颚口线虫的分类鉴定研究

黄燕琼，邓 艳，张 森，何淑华，戴 金，柏建山

（1.广州机场出入境检验检疫局/国家水产品检测重点实验室，广东 广州 510470；2.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640）

颚口线虫病是一种食源性疾病，由旋尾目（spirurid）的颚口线虫引起。当人体食入生的或未熟的感染颚口线虫的食物后可能感染颚口线虫，引起移行性皮下包块和匐行疹，虫体也可侵入人体重要器官，如肝脏、肾脏、肺脏、眼睛甚至中枢神经系，引起严重后果甚至死亡［1］。目前，颚口线虫有13个有效种、5个致病种（4种分布在亚洲，1种分布在拉丁美洲）。棘颚口线虫是亚洲地区的主要致病种，首次被发现是在伦敦动物园的老虎胃内。刚刺颚口线虫、日本颚口线虫和杜氏颚口线虫病例主要发生在日本［2］，双核颚口线虫是拉美地区流行的唯一虫种［3］。在墨西哥和泰国，已报道的病例均超过9 000例，日本病例4 000例［4］。

感染人体患病的主要是颚口线虫第三期幼虫，其宿主广泛，其中淡水鱼是颚口线虫的重要宿主，也是感染人体的重要来源。在淡水鱼中，泥鳅和黄鳝的感染率非常高，这两种鱼类在亚洲地区广泛存在，在很多调查中，黄鳝的感染率很高［5］，在东南亚有些地区黄鳝的感染率可达100%，泥鳅中也经常发现颚口线虫。本调查对从广州机场口岸入境的黄鳝以及国内的黄鳝、泥鳅感染情况进行调查和分类鉴定，以期为颚口线虫的防控提供重要的参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 国外虫体来源于广州机场口岸入境的黄鳝，进口自印度尼西亚和菲律宾。国内虫体来源于不同地区市场所售泥鳅和黄鳝，包括广东广州、福建漳州、吉林长春、重庆、四川内江、湖北荆州。

1.1.2 主要仪器 生物显微镜（Lecia DM5000B）、体视显微镜（Lecia S8APO）、恒温振荡器（THZ-D）、冷冻离心机（Siama 3K15）、梯度PCR仪（BIOMETRA TRRADIENT） 、电泳仪（BIA-RAD、PowerPac Basic）、凝胶成像系统（VILBER）、手术刀、小镊子、昆虫针、载玻片、盖玻片。

1.1.3 主要试剂 8.5 g/L生理盐水、胃蛋白酶-浓盐酸消化液、酒精、乳酸-酚-甘油混合透明液，试剂配制方法参照《淡水鱼中寄生虫检疫技术规范》和《水产品中颚口线虫检疫技术规范》。TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit试剂盒、Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒、Plasmid Purification Kit Ver.4.0试剂盒、10×PCR buffer、dNTP、Taq酶、pMD18-T载体、DH5α感受态细胞，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 颚口线虫虫体的分离 逐条剖开黄鳝，检查腹腔内虫体感染情况，再分离头部，剪碎肌肉和肝脏后，用消化液对其进行消化，过夜消化至消化液内无明显组织，将消化液滤过孔径2.0 mm的筛，吸去上清液，加水搅拌后沉淀20～30 min，再吸去上清液，用清水反复清洗几次，直至上清液透明为止，分离出虫体，置于有生理盐水的培养皿中。泥鳅的消化方法与黄鳝类似，但由于泥鳅个体偏小，没有逐条进行消化，而是直接称重，数条泥鳅一起消化。

1.2.2 虫体的形态学鉴定 用体视显微镜观察，疑似颚口线虫的虫体发黄，头部有棘突，卷曲，体长一般2～5 mm，在生理盐水中卷曲或有包囊包住，将虫体放入乳酚透明液中，至透明后，置于载玻片上，在生物显微镜下观察。观察鉴定后将虫体放入装有75%酒精的离心管中-20℃保存。

1.2.3 虫体DNA提取 将单条虫体从75%酒精的离心管中取出，置于经灭菌的1.5 mL离心管中，用纯水洗净后用研磨棒研磨，后根据TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit试剂盒的步骤提取虫体基因组DNA。将基因组DNA置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.4 PCR扩增ITS2序列 对颚口线虫ITS2序列进行PCR扩增，引物信息见表1，扩增体系如下：2.5μL 10×PCR buffer，2.5μL Mg2+，1μL dNTP，1μL PE-5.8S引物，1μL PE-28S引物，0.5μLTaq酶，1μL DNA模板，用超纯水补足至25μL。反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性 30 s、55℃退火 30 s、72℃延伸 30 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。取反应产物5μL在1%琼脂糖凝胶中进行电泳20 min，在凝胶成像系统中观察并拍照记录结果。

表1 对颚口线虫ITS2序列扩增引物［6］

1.2.5 扩增片段回收克隆 使用Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒，按照说明书步骤进行PCR扩增片段的纯化回收，将纯化产物连接到pMD 18-T载体上，然后转化至感受态细胞DH5α中培养，将DH5α感受态细胞培养液涂布到含有氨苄青霉素、IPTG、X-gal的LB琼脂平板上，37℃恒温培养12 h，再进行蓝白斑筛选（方法参照《分子克隆实验指南》第3版），挑取单个白色菌落，按照Takara公司的Plasmid Purification Kit Ver.4.0试剂盒说明书步骤进行质粒提取。将质粒置于-20℃冰箱保存。

1.2.6 测序、构建系统进化树 将阳性克隆质粒送Invitrogen公司进行测序，校正处理获得的序列，使用NCBI的BLAST在线工具进行序列比对。在GenBank中获取不同种颚口线虫的ITS序列，包括棘颚口线虫（G. spinigerumn，登录号为KP784343）、杜氏颚口线虫（G.doloresi，登录号为AB181156）、双核颚口线虫（G. binucleatum，登录号为EU334741）日本颚口线虫（G. nipponicum，登录号为JQ824051）、刚刺颚口线虫（G. hispidum，登录号为JQ824057）、膨胀颚口线虫（G.turgidum，登录号为KF648548）、宫崎颚口线虫（G. miyazakii，登录号为FJ497055）、G. lamothei（登录号为EU334738）、美丽筒线虫（G. pulchrum，登录号为AB646106）。将测序结果与下载的ITS2序列用ClustalX软件进行差异性分析，并进行必要调整，然后用MEGA5.0（Molecular Evolutionary Genetic Analysis 5.0 version）软件，使用最大似然法（Maximum Likelihood）构建系统发生树，自展值（Bootstrap values）重复1000次。

2 结果与分析

2.1 广州机场口岸入境黄鳝中颚口线虫的检查情况

广州机场口岸入境的黄鳝主要来自菲律宾和印度尼西亚，这是入境水产品中唯一的一种淡水鱼，对每一批次黄鳝进行抽样调查（共19批次，其中12批次来自印度尼西亚、7批次来自菲律宾）。从表2可以看出，印度尼西亚的黄鳝感染率较高，批次阳性率达到91.7%，感染强度1～9条不等；菲律宾黄鳝中没有发现颚口线虫。

术后两组患者均常规使用替硝唑片(厂家：湖南迪诺制药有限公司，批准文号：国药准字H43020659，规格：0.5 g)抗感染治疗，剂量为1 g/次，1次/d；同时采用补佳乐(厂家：拜耳医药保健有限公司，批准文号：国药准字J20171038，规格：1 mg)加黄体酮胶囊(厂家：浙江仙琚制药股份有限公司，批准文号：国药准字H20041902,规格：50 mg)治疗，剂量分别为2 mg/次、100 mg/次，1日2次。以21 d为1个治疗周期，停药7 d后再进行下1周期治疗，两组患者均治疗3个人工周期。3个月后，取出人羊膜包裹球囊和节育器，并记录两组患者疗效。

2.2 国内部分省市市售黄鳝和泥鳅中颚口线虫的检查情况

2015年9～12月，对国内广东广州、重庆、四川内江、湖北荆州、福建漳州和吉林长春的部分市售黄鳝和泥鳅进行了检查，只在漳州的泥鳅中发现了18条虫体，在黄鳝中发现了1条虫体，其他地区均无发现虫体（表3）。因为本次检查的时间较短、样本有限，数据只能作为参考，需要进一步的调查。

2.3 形态学鉴定结果

在体视显微镜下，活体稍透明，呈黄色，头部和尾部都向内卷曲，呈盘旋状；死亡虫体呈半透明，头部伸直，尾部向头部卷曲呈半环（图1 A、B，彩插四）。透明后在生物显微镜下观察，虫体表面可见到体棘，约2～5 mm，向后延伸逐渐变细；虫体可明显分为唇部、头球和体部3个部分，唇部向前突出，位于头球前端；头球表面有棘突，内部向下连接4个颈囊；食道与口唇相连，食道颜色较浅，从前端向后逐渐膨胀，在最膨大处于肠道相连，界限明显，肠道较细，有弯曲，颜色深，长度大约是食道的1.5倍（图1 C、D，彩插四）。

在高倍生物显微镜下进一步观察，初步鉴定为3种颚口线虫，福建漳州黄鳝中虫体为棘

颚口线虫，泥鳅中虫体1条为棘颚口线虫，17条为日本颚口线虫，印度尼西亚黄鳝中检出9条刚刺颚口线虫，其余全部为棘颚口线虫。

表2 广州机场口岸入境黄鳝中颚口线虫的检查情况

（1）棘颚口线虫：虫体较大，体长4～5 mm，各个器官清晰可见，唇部位于头球中央顶端，有两对突起，共两对颈囊，每侧分布1对，食道与肠道交界如漏斗状，尾端可见肛门和尾感器，头球表面有棘突，呈不规则长方形，共4环棘突：第一环棘突数为40～47，第二环为37～49，第三环为42～57，第四环为42～48；颈乳突位于11～16体环处。根据这些特征初步判断为棘颚口线虫（图2，彩插四）。

（2）刚刺颚口线虫：在高倍生物显微镜下观察，虫体各部分结构符合颚口线虫形态，头球棘突呈不规则哑铃型，共4环：第一环棘突数约为40，棘突数向后逐渐增加，第四环约为48；颈乳突位于9～14环体棘之间。根据以上特征初步鉴定为刚刺颚口线虫（图3，彩插四）。

2.4 ITS2序列PCR扩增结果

以编号为Gn-FJ1～Gn-FJ6和Gn-In1～Gn-In13的线虫基因组DNA为模板，使用颚口线虫ITS2通用引物PE-5.8S和PE-28S进行PCR扩增，片段约640 bp，与预期片段大小相符（图5）。

图5 部分颚口线虫ITS2序列PCR产物电泳结果

2.5 序列分析

样品测序结果经Blast分析比对，Gn-FJ5、Gn-FJ6、Gn-In1～Gn-In9、Gn-In12和 Gn-In13的ITS2序列与GenBank中已知的棘颚口线虫（G. spinigerumn）相应基因序列（登录号为KP784343）同源性达99%～100%；样品Gn-FJ1～Gn-FJ4与日本颚口线虫（G. nipponicum）同源性达99%～100%（登录号为JQ824051）；样品Gn-In10和Gn-In11的序列比对结果与刚刺颚口线虫（G. hispidum）同源性达100%（登录号为JQ824057）。

2.6 构建系统进化树

图 6 基于ITS2序列以最大似然法构建的系统进化树

对19个样品的ITS序列进行多重比对后进行必要调整，采用M-L法构建系统发生树。从系统进化树拓扑图（图6）可以看出，颚口线虫属对应美丽筒线虫构成一个大分支，Gn-FJ5、Gn-FJ6、Gn-In1～Gn-In9、Gn-In12和 Gn-In13与棘颚口线虫构成自展值为99%的独立分支，这个分支又与双核颚口线虫组成一个自展值为87%分支；Gn-FJ1～Gn-FJ4与日本颚口线虫构成自展值为90%的独立分支；Gn-In10和Gn-In11与刚刺颚口线虫构成自展值为98%的独立分支，又与杜氏颚口线虫构成一个自展值为98%的拓扑结构分支。一些可信度比较高的分支与这些虫体的某些特性吻合，如膨胀颚口线虫的形体是颚口线虫中最大的，与其他虫体形态差异明显，在进化树中独立自成一支，说明其可能与其他虫体的遗传距离较远；刚刺颚口线虫和杜氏颚口线虫的终末宿主均为猪和野猪，它们的生活史比较接近，在进化树中，这两个虫种组成一个自展值为98%的分支，表明它们的遗传距离较近；而棘颚口线虫是亚洲地区的主要致病种，双核颚口线虫是美洲地区的主要致病种，两者组成一个自展值87%的分支，说明两者遗传距离较近，是否与其致病性有一定关系还不得知，需要进一步研究；其他虫种分支的自展值比较低，存在很大不确定因素，需要结合其他基因作进一步研究。

3 讨论

本次从国内的黄鳝和泥鳅中发现了少量颚口线虫，集中在福建漳州地区，187条泥鳅中发现了18条颚口线虫，其中17条为日本颚口线虫、1条为棘颚口线虫，10条黄鳝中发现了1条棘颚口线虫。虽然虫体不多，但也说明了福建漳州地区存在颚口线虫。购买的黄鳝和泥鳅有些是通过野生捕捞获得，有些来自人工养殖，这对调查的结果造成一定影响。

棘颚口线虫是世界范围内广泛的颚口线虫，在欧亚、大洋洲、非洲、美洲都有发现，在我国北京、上海、江苏、福建、广东等10余省市均有报道，亚洲地区包括我国的绝大部分颚口线虫病是由棘颚口线虫引起，此次国内的检查中在福建漳州的黄鳝和泥鳅体内各发现1条棘颚口线虫，应该引起高度重视。

本研究在福建首次发现日本颚口线虫，2012年李雯雯等［7］在广州和黑龙江泥鳅中分离到日本颚口线虫，为首次在我国本土发现日本颚口线虫。在此之前中国出口到韩国和日本的泥鳅中有发现日本颚口线虫［8］。本研究再一次证明我国本土存在日本颚口线虫，在国内可能广泛分布［9-13］，需要作进一步调查研究。

对广州机场口岸入境的黄鳝进行检查，印度尼西亚的黄鳝颚口线虫感染率较高、为27.9%，而菲律宾黄鳝中没有分离到颚口线虫。印度尼西亚和菲律宾的黄鳝在入境时均申报为野外捕捞，在检查中发现印度尼西亚的黄鳝大小参差不齐，体内有大量其他寄生虫，如棘头虫、吸虫、胃瘤线虫等虫体，说明其生长环境复杂；而菲律宾的黄鳝体型较大且均一，体内的寄生虫很少，说明其生长环境单一。仅2016年，从广州白云机场口岸入境的印度尼西亚黄鳝为1379.049 t，菲律宾黄鳝为802.659 t，而且黄鳝的入境数量逐年增长，尤其是现在冰镇黄鳝等食用方法比较流行，但该方法并不能彻底杀死寄生在肌肉内的颚口线虫，因此需要特别重视入境黄鳝的寄生虫检疫工作［14］。

［1］ Katchanov J，Sawanyawisuth K，Chotmongkol V，et al. Neurognathostomiasis，a neglected parasitosis of the central nervous system［J］.Emerging Infectious Diseases，2011，17（7）：1174-1180.

［2］ Nawa Y. Historical review and current status of gnathostomiasis in Asia.［J］. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine & Public Health，1991，22 （S1）：217-219.

［3］ Murrell K D，Murrell K D. Food-Borne Parasitic Zoonoses［M］. New York：World Class Parasites，2007.

［4］ Ando K. Gnathostomiasis in Japan［M］. Foodborne helminthiasis in Asia，AAA Committee ：the Federation of Asian Parasitologists，2005：1，231-239.

［5］ Rojekittikhun W，Waikagul J，Chaiyasith T.Fish as the natural second intermediate host ofGnathostoma spinigerum［J］. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine & Public Health，2002，33（Sl3）：63-69.

［6］ Ando K，Tsunemori M，Akahane H，et al.Comparative study on DNA sequences of ribosomal DNA and cytochrome c oxidase subunit 1 of mitochondrial DNA among five species of gnathostomes［J］. Journal of Helminthology，2006，80（1）：7-13.

［7］ 李雯雯，李树清，张子群，等. 黑龙江与广州颚口线虫幼虫分离株的形态学观察及其分子鉴定［J］. 中国预防兽医学报，2012（2）：104-107.

［8］ Sohn W M，Kho W G，Lee S H. LarvalGnathostoma nipponicumfound in the imported Chinese loaches［J］. Korean Journal of Parasitology，1993，31（4）：347.

［9］ 陈清泉，林秀敏. 刚刺颚口线虫病流行区的发现及其生物学研究［J］. 厦门大学学报（自然科学版），1990（2）：214-217.

［10］ 林秀敏，陈清泉，彭文峰. 江西省九江地区刚刺颚口线虫病流行学调查［J］. 武夷科学，1992（9）：245-248.

［11］ 黄锦源，林金祥，张良应，等. 福建省将乐县猪体感染颚口线虫调查研究［J］. 中国人兽共患病学报，2008（1）：89-90.

［12］ 林开铅，陈月香，张榕燕，等. 将乐县野猪陶氏颚口线虫病流行现状调查及虫卵发育至早期第三期幼虫的试验观察［J］. 福建畜牧兽医，2011（4）：1-3.

［13］ 张鸿满，吴慧芳，江河，等. 广西市售部分水产品中颚口线虫感染情况调查研究［J］. 应用预防医学，2012（4）：193-196.

［14］ 李树清，李雯雯，陈志飞，等. 入境黄鳝颚口线虫检疫及虫种鉴定［J］. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2011（5）：358-362.