不同状态紫萼藓总RNA提取效果的比较

2018-01-25杭玉敏

山西青年 2018年3期

杭玉敏

(山西师范大学教师教育学院，山西临汾 041000)

在生态系统中，苔藓的地位是举足轻重的，在植物界的系统演化过程中具有特殊的地位[1]，它能作为监测空气污染程度的指示植物。高质量的RNA对生物的研究有很重要的意义，尤其是分子方面，因此，如果能从苔藓植物组织中分离到质量比较好的RNA是顺利进行一些分子学研究的助推器。

一、研究目标

本研究以不同状态的紫萼藓作为研究对象，用同一种方法提取RNA，通过检测提取出的RNA纯度从而对不同状态的紫萼藓提取情况进行比较。

二、研究内容

(一)采集紫萼藓后干燥处理一部分，在培养皿里培养一部分，实验前将紫萼藓去根进行冷冻过夜处理，同时也可将研钵进行遇冷处理；

(二)取100mg自然生长新鲜紫萼藓若干份和90mg干燥处理的紫萼藓若干份，将以上材料用改进的SDS法提取紫萼藓的总RNA；

(三)将提取出的RNA样品用DEPC水稀释20倍，再用紫外分光光度计检测提取到的总RNAOD260/OD280比值；

(四)记录测量到的总RNA的OD260/OD280比值，通过分析该比值的大小来说明什么状态下的紫萼藓更适合总RNA的提取。

三、方法与步骤

在进行以下所有的实验方法时，所用到的所有玻璃器皿和研钵在使用前都要进行高压灭菌；用0.1%的DEPC水浸泡塑料离心管和枪头，浸泡时间最低12h，之后再进行高压灭菌。配制好的溶液在进行具体的实验操作前也需要进行高压蒸汽灭菌，所有实验过程都要尽量避免外源RNA酶的影响。

改进的SDS法提取紫萼藓RNA

(1)将所需要的全部紫萼藓进行去根处理，置于冰箱冷冻(-24℃)过夜，同时将研钵也进行遇冷处理；(2)制备SDS提取缓冲液；(3)在六个1.5mL的离心管中先后加入SDS提取缓冲液(500μL)、水饱和酚(300μL)和β-巯基乙醇(100μL)；(4)称取100mg三份培养皿培养的新鲜紫萼藓和90mg三份干燥处理的紫萼藓，取称量好的紫萼藓置于研钵中，每份紫萼藓加100mgPVP研磨成粉末，研磨后迅速加入上述离心管中，每次研磨后用蒸馏水对研钵进行适当清洗；(5)分别再在上述每一离心管中加入70%的无水乙醇(200μL)，再加入KAc(200μL)，适当摇匀后在4℃、12000r/min的条件下离心10min；(6)将离心管中的水相分别转移至另外六个离心管中，加苯酚异戊醇至1.5mL刻度处，混匀后4℃、12000r/min条件离心10min；(7)用塑料吸管吸取水相于另外六个干净的离心管中，加NaAc和70%无水乙醇，-24℃产生沉淀后与以上相同离心条件离心10min，用NaAc(500μL)洗涤沉淀后于相同条件下离心5min；(8)离心后的沉淀转移后加DEPC水溶解，之后再加入NaAc(20μL)和70%的乙醇(500μL)，混匀后-24℃使RNA进行沉淀，再进行离心15min使其充分沉淀；(9)将所得到的RNA用配制的75%的乙醇洗后，用DEPC的水溶解，-24℃保存备用。

四、实验结果与分析

(一)实验结果

取提取出的培养皿培养的新鲜的和干燥处理的紫萼藓总RNA，用DEPC水稀释20倍后用紫外分光光度仪测其OD260/OD280的比值。干燥处理的样本和培养皿培养的新鲜样本提取出的总RNA OD260/OD280的平均值分别为1.12和0.97，由此可得：就同一种方法而言，用干燥样本提取出的RNA OD260/OD280值比培养皿水培培养的新鲜紫萼藓的值高，因此可推断同一方法用干燥样本提取出的RNA纯度更高。

(二)结果分析

用以上方法得到的OD260/OD280比值没有达到满意的效果，其原因可能为：第一、RNA在提出前就已经被降解，RNA酶无处不在，实验过程中枪头和离心管虽然用DEPC水浸泡，但是在转移的过程中难免会有酶污染，研钵和配制好的溶液也会有RNA酶，实验过程中最后导致提取出的RNA酶含量很少；第二、有蛋白质等其他杂质的在实验后会有残留，实验药品也会有残留；第三、实验操作过程中研磨后的紫萼藓不能全部转移到离心管中，导致RNA浪费以及实验操作过程中出现的一些不规范和失误都会导致所提取的RNA纯度不高。

而根据结果可以分析出干燥的紫萼藓提取出的总RNA质量更高些，其原因可能是：第一、研钵体积较大，研磨材料较少，湿的材料比干的材料更容易粘在器皿上；第二、加入PVP螯合剂，干燥的材料能研磨地比较细致，而新鲜的材料在研磨是水分比较多，这样会影响RNA的释放量；实验过程中会使用一些试剂使蛋白质等杂质与RNA分离，而药品的使用对干燥材料和新鲜材料作用也是不一样的。