间充质干细胞移植治疗骨质疏松研究进展*

艾菊青，毛浩萍

（天津中医药大学，天津 300193）

骨质疏松症（OP）是以骨量减少、骨组织微细结构退化、破坏，导致骨脆性和骨折危险性增加为特征的一种全身性、代谢性骨骼疾病[1]。年龄逐步增长或女性进入绝经期，体内性激素水平的骤减、钙调节激素的分泌紊乱及微量元素的摄入不足是导致老年和绝经女性原发性OP的重要病因。随着经济的发展和医疗技术的进步，OP治疗花费亦在逐年增加。根据2009年国际骨质疏松症基金会首次在亚洲14个国家开展的骨骼健康状况和OP的综合性研究报告指出：至2020年，中国OP或低骨密度患者将达到2.866亿人次，而因骨质疏松引起的髋部骨折治疗经费将达到850亿元，至2050年患者人数则将跃升至5.333亿；治疗经费更剧增至1.8万亿元[2]。因此世界卫生组织（WHO）将OP列为心血管疾病之后的第二位健康问题，但目前尚未完全阐明OP的发生机制。间充质干细胞（MSCs）是来源中胚层存在于骨髓及多种组织中的多向分化的一类干细胞，可向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞及神经细胞等分化。MSCs符合干细胞所特有的自我更新和多向分化的潜能，又不具有致畸胎瘤的风险，因此MSCs刚被鉴定不久研究者就尝试利用MSCs移植治疗多种疾病[3-5]。多项研究证实，OP的发生与MSCs向脂肪和成骨分化失衡密切相关，因此，本文拟围绕MSCs与OP间的关系及现存有问题进行综述，旨在为MSCs移植治疗OP提供一定理论依据。

1 MSCs概述

Friedenstein等[6]最早发现MSCs是一类存在于骨髓，具有呈纤维样贴壁非造血细胞。随后诸多深入实验表明MSCs呈克隆样单个核细胞团，具有较强的增殖能力和一定的自我更新能力并有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的潜能。MSCs存在多种组织器官中，如骨髓、脐带血、脂肪、肺、肝及皮肤，但在不同组织中占有比例不同：占骨髓有核细胞的0.001%-0.01%[7]，在羊水中具有较高的比例为0.9%～1.5%[8]。目前并未有公认的MSCs表面分子鉴定金标准，而依据其来源种属的不同具有相应差异，如来源于人的MSCs表面标记至少应该具有Strom-1，CD44，CD71，CD90，CD105 的高表达；源于小鼠的为 Sca-1，CD105，CD140a，CD44 的高表达；造血和内皮则标记为阴性，如CD45，CD31，CD34，CD11b，CD79c等[9]。并且多项研究显示来源于机体不同部位的MSCs，其表面分子表达标记也具有差异性，如来源于脂肪组织的MSCs会高表达CD45，而来源于骨髓的MSCs则高表达CD271，表明MSCs的表面分子表达具有不稳定性，这可能与MSCs异质性、体外培养时间和代数等多种原因相关，同时也需要更多深入的研究来探索和准确的鉴定MSCs表面分子标记。

MSCs作为脂肪细胞和成骨细胞的同源体，当成骨-脂肪间失衡，就能引起OP。研究表明老化促进MSCs向脂肪细胞转化，可能是由于老化引起活性氧簇（ROS）增加，激活过氧化酶体增殖物激活（PPAR）受体，从而导致MSCs向脂肪细胞分化增多，造成成骨-脂肪的失衡[10-11]；李东菊等的研究也证实去势后大鼠MSCs增殖能力及成骨分化能力减弱，且趋向脂肪细胞进行分化[12]。同时，MSCs可分泌多种生长因子和细胞因子，利于受损组织进行修复，如MSCs通过分泌骨形成蛋白（BMPs）进行软骨、骨及肌腱等修复[13]。且MSCs的获得不受伦理限制，也无并发畸胎瘤等风险，MSCs具有易获得性及明确的成骨分化能力，均为日后其移植治疗骨质疏松奠定了基础。

2 MSCs移植治疗OP的可行性

由于MSCs具有广泛的获得性并拥有多向分化的潜能，且多项研究表明MSCs能够在机体组织损伤、生长及愈合中进行替换和更新体内细胞。因此，被认为具有较强促再生能力的MSCs在治疗OP中具有广泛的应用前景。

2.1单纯的MSCs移植治疗OP 作为脂肪细胞和成骨细胞的同源体，MSCs数量的减少或功能的缺损，会直接引起OP，因此，系统或局部移植正常功能的MSCs被认为对治疗OP具有一定的疗效。

Deepshikha T等[14]研究去势后大鼠MSCs修复功能，采用流式细胞术观察去势后大鼠MSCs数量的变化，发现去势后大鼠MSCs干细胞表面分子标记CD90和CD54表达率明显下降，且去势后大鼠的MSCs更倾向于脂肪细胞分化；而后分别将去势后大鼠的MSCs及正常大鼠的MSCs移植至骨折大鼠，3 h后采用双探头单光子发射计算机断层成像术（SPECT/CT）扫描，结果显示，尽管去势后大鼠的MSCs也具有改善钙结合能力及提高骨折区域骨量的功能，但效果明显低于正常组的MSCs，且归巢至骨折区域去势大鼠的MSCs明显少于正常组的MSCs。Jinhui S等[15]分别将1～2月龄的年轻小鼠和20～24月龄自然衰老老年小鼠的BMMSC移植至自然衰老的雌性小鼠中，6个月后发现移植年轻小鼠MSCs组骨膜有更多的MSCs，且骨钙素（OC）含量要远高于老年组，这也证实了老化后MSCs的增殖、归巢及成骨分化能力均要减弱，另外同时发现移植至年轻小鼠MSCs组的小鼠平均寿命长于老年组。Dmitriy等首先应用脊柱损伤大鼠，并分别采用MSCs移植或PTH注射单治疗法或联合治疗2周，观察脊柱伤口愈合情况，结果显示PTH注射可以提高MSCs迁移至骨折区，并促进MSCs向成骨细胞分化，从而促进脊柱伤口的愈合。并且为了进一步研究MSCs对脊柱损伤的作用情况，采用猪自分泌的MSCs，对脊柱损伤的小猪进行了同样的MSCs移植治疗，结果显示移植后的MSCs具有减缓损伤区域的骨丢失情况，这些研究结果表明PTH可能是作为一种黏合剂，从而促进移植MSCs向损伤区域迁移，并进一步分化为成骨细胞，并阻止骨量丢失。

2.2修饰后MSCs移植治疗OP 虽然多项研究证实未经任何修饰的MSCs移植虽然能够驻留于骨，并具有一定增殖能力，且能够向成骨细胞分化，增加成骨细胞的数量，因此在一定程度上能够逆转骨流失，但由于宿体移植后MSCs归巢数量少，且驻留时长短等问题，造成MSCs治疗疗效存有争议，因此，研究者通过基因修饰MSCs，期望以此提高MSCs治疗OP效果。

Yao W等[16]发现移植单纯MSCs仅能在机体停留4～8周，导致MSCs疗法效果甚微，因此，为了提高MSCs疗效，他们将双磷酸盐和MSCs表面高表达的整合素a4β1的拟态物配体（LL2A）制成混合物后，再与MSC复合后同时静脉注入去势小鼠，研究结果表明相比于单纯的MSCs移植，LL2A-Ale与MSCs复合物可通过介导细胞外基质促进MSCs的归巢。Sun WC等[17]采取逆转录病毒介导的方法将核因子kB活化因子（RANK-Fc）和（或）趋化因子受体4（CXCR4）整合至MSCs基因组中，结果发现，静脉注射至去势后小鼠体内，过表达RANK-Fc和CXCR4的MSCs均可改善去势后引起的OP，且趋化因子受体CXCR4-MSCs更能提高MSCs的归巢数量。

3 MSCs移植治疗OP机制研究

3.1MSCs归巢作用 MSCs的归巢是OP治疗重要环节，需要多种趋化因子和蛋白等参与其中，首先，MSCs通过卷曲栓附等形式与内皮组织进行接触，接着在G蛋白耦合因子活化、整合素介导等激活因素下，MSCs穿过内皮组织，从而到达基底膜完成归巢过程[18]。

SDF1/CXCR4被认为是影响MSCs归巢中最主要的信号通路，基质细胞衍生因子（SDF-1）最早被认为由干细胞分泌的可溶性配体，为B祖细胞生长因子[19]，随着研究的深入，SDF-1并不同于其他炎症因子诱导的产生趋化因子，它由基质细胞持续产生，并为B淋巴细胞、骨髓髓系细胞及心血管内皮细胞等生长所必须的，而CXCR-4是目前已知的SDF-1唯一受体。源于骨髓的MSCs表达CXCR4，当受损组织如心、脑、肾、骨等具有SDF-1高表达，在AKT及P38等信号通路参与下，调控CXCR-4-MSCs迁移至受损部位[20-22]。

3.2MSCs分泌细胞因子作用 研究显示当局部多种炎症因子和缺氧等环境刺激，MSCs可通过自身及旁分泌多种细胞因子和生长因子促进骨组织再生和修复。Nixon AJ等发现MSCs移植至宿体后，能够分泌多种细胞因子如生长转换因子-1（TGF-β1），胰岛素样生长因子（IGF-I和BMP2等），促进软骨、骨及肌腱等受损组织的修复[9]。同时，外源性的MSCs进入机体后，分泌生长因子激活损伤组织周围的干细胞，因此当外源性MSCs凋亡或者不再在损伤部位驻留时，依然可以产生显著的治疗效果。不同于MSCs直接分化为成骨细胞，移植至机体的MSCs分泌多种因子，激活和启动宿主自身的再生过程发挥着更为广泛的作用。

3.3与内皮细胞共同作用 研究发现MSCs需要与内皮组织接触后迁移至受损部位，MSCs如何与内皮组织作用机制尚未完全明确，有研究[23]显示肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可激活内皮细胞从而提高两者的结合，并且在这过程中MSCs会分泌一系列的黏附因子，Steingen C等[24]发现是内皮细胞的经典表型，如血管细胞黏附分子-1（VCAM-1），整合素β1和基质金属蛋白2（MMP-2）调控，如内皮细胞表达的VACM-1与MSCs表达的VLA-4结合后介导MSCs迁移。

4 MSCs移植治疗OP存在的问题

尽管MSCs发现较早，并进行相关研究多年，且MSCs疗法治疗多种疾病作用及机制亦得到验证，然而在追求MSCs疗效最优化且具较高安全性的同时，控制其适宜注射量、采取恰当的移植方式及达到优化疗效的途径仍是现在亟需广大研究者解决的问题。

4.1MSCs细胞注射量及注射途径 目前，MSCs移植治疗OP还多停留于动物实验阶段，MSCs细胞治疗量暂无统一标准，研究者多采用1～5×106个/kg的细胞数[25]，且注射途径也未统一，多数研究者采用尾静脉注射的方式。因尾静脉注射会造成MSCs细胞的丢失，并会促进MSCs向肺脏归巢，故Shuo H等[26]采用心脏注射方式。Taketoshi K等[27]采用局部注射方法，直接向骨折区域注射MSCs，认为可以提高MSCs的归巢数量，但也有研究认为无论是系统移植还是局部移植，MSCs细胞归巢的效率并没有差别。

4.2MSCs体外培养时间及代数对疗效的影响 虽然MSCs存在于机体大部分组织中，但是比例却非常低，因此体外培养扩增是MSCs治疗的前期基础。而目前尚未对MSCs细胞代数作统一规定，研究显示随着MSCs体外培养时间的增加，会弱化MSCs的归巢能力。Rombouts等[28]通过系统移植未在体外培养的EGFP-MSCs至清髓的C57BL/6小鼠中，24 h后发现有55%～65%MSCs能够归巢至骨髓中，说明原代MSCs具有较高的归巢能力；研究者又分别移植了体外培养24 h和48 h的MSCs至清髓的C57/BL小鼠中，结果显示体外培养24 h的MSCs导致MSCs归巢能力降低至10%，而将MSCs体外培养48 h后，未能在骨髓等造血组织中发现MSCs，表明MSCs完全丢失了归巢能力。James DK等[29]取新生6 d小鼠骨髓中MSCs，进行体外成骨诱导培养，应用茜素红染色计算钙沉积面积比，结果显示P1 MSCs诱导的钙沉积面积比为（46.7±9.0），胞外钙含量为（0.27±0.06），而到P6时，MSCs诱导的钙沉积面积比降低至（31.1±10.1），胞外钙含量为（0.2±0.04），表明随着MSCs体外培养代数的增加，其成骨能力会逐渐减弱，但这仅局限于新生小鼠的MSCs，研究者发现6周和1 a老年的小鼠MSCs并不因为代数的增加而导致成骨能力降低，这可能与MSCs异质性及体外增殖能力有关。

4.3MSCs细胞归巢数量 尽管研究证实自体或异体MSCs系统移植均可改善OP，但多项研究表明移植后由于MSCs归巢数量有限及驻留时长问题，导致MSCs治疗OP有效率下降。Shuo H等[26]进行系统移植MSC，运用小动物活体成像技术观察移植MSCs后不同时间点细胞归巢数量，结果发现移植1 h后，MSCs基本聚集在肺脏，移植5～8 d后，在骨折区仅有微弱的MSCs荧光信号，且持续1～3 d后消失。RE Ploemacher课题组[27]考察体外培养不同时间后MSCs归巢能力，结果显示随着体外培养时间的增加，MSCs归巢能力逐渐减弱。针对这些问题，研究人员也在不断的思考，尝试各种方法以试图解决这些阻碍。如对MSCs进行基因修饰，由于CXCR4/SDF-1轴被认为是MSCs归巢过程最为重要的通路，而MSCs表达CXCR4水平并不高，因此通过转染等技术使得CXCR4在MSCs中过表达，以此提高MSCs归巢能力。诸多研究者利用基因修饰技术进行类似实验，改造MSCs归巢相关的基因，如整合素a4等，希冀提高MSCs归巢效率，但与此同时，也带来了免疫反应及MSCs增殖能力减弱等问题。

5 小结

自2004年以来，与MSCs相关的临床试验项目数量在全球范围内明显增加，表明MSCs治疗方案具有广泛的应用前景，虽然目前仍有许多问题亟需研究者解决，包括如何获得纯度较高的MSCs；如何提高MSCs细胞归巢数量，选取合适细胞代数、细胞数量及治疗时间窗等，但在骨组织再生领域中，MSCs移植治疗可作为新策略实现骨组织再生和修复。正如前所述，MSCs移植后可直接增加骨内MSCs总数量，提高成骨分化，更为重要的是可分泌多种趋化因子，这些趋化因子对于OP引发的骨折具有重要的治疗意义，且MSCs治疗相对传统药物治疗具有治疗时间短、方式便捷等优势，因此随着研究者对MSCs认识的不断深入，目前未释疑问题将逐步解决，该治疗方法因其具有传统治疗方法不可比拟的优势，终将应用于OP的临床治疗。

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