北美H7亚型禽流感病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

王晨曦,张谞霄,蒲 娟,孙洪磊

(中国农业大学动物医学院， 北京 海淀 100193)

禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的禽类高度接触性传染病。根据该病毒对鸡的致病性，可将其分为低致病性禽流感(LPAI)病毒和高致病性禽流感(HPAI)病毒。目前认为，HPAI主要由H5和H7亚型引起[1]。其中H7亚型AIV已在全球多个地区中发现，不仅波及的国家和地区较广，而且暴发的亚型多样，对人类健康也有严重的威胁，特别是新型H7N9流感病毒感染人的报道更是引发了人们的广泛关注。

根据血凝素(HA)基因的分子遗传进化特点，H7亚型AIV可以分为欧亚和北美两个进化分支，我国自然分离到的H7亚型AIV均属于欧亚分支[2]。在美国，LPAI和HPAI H7亚型均在家禽中暴发，并造成严重的经济损失。同时，北美分支的H7亚型流感病毒也多次引起人类感染发病[3-5]。研究表明，与欧亚分支的H7亚型AIV相比，北美分支的H7亚型AIV获得了更强的α-2,6唾液酸糖苷结合能力，而α-2,6唾液酸糖苷为人类上呼吸道主要分布的流感病毒受体，因此推测该类病毒具有更强的跨物种感染能力[6]。同时动物实验也证实，部分北美分支H7亚型AIV能够在哺乳动物模型雪貂间发生有效的接触传播，在人际间流行的可能性更大[6]。因此，北美分支H7亚型AIV的公共卫生学意义值得关注。

截至目前，我国尚未有人或禽类感染北美H7亚型流感病毒的报道，但是频繁的禽产品贸易交流以及候鸟迁徙都可能将北美源H7亚型AIV传入我国。我们之前的研究已经建立了针对北美H7亚型AIV HA基因的RT-PCR检测方法，该方法具有良好的特异性和敏感性，适合基层实验室应用[7]。实时荧光定量PCR能够实现对模板的定量，具有特异性好、灵敏度高、结果直观、重复性高等优点，已广泛应用于流感病毒的检测[8-9]。因此，建立北美H7亚型AIV实时荧光定量PCR检测方法，能够为监测北美源H7 亚型AIV入境传播提供更加准确、有效的工具。

1 材料与方法

1.1 质粒与病毒 北美H7亚型流感病毒A/New York/107/2003 (H7N2) HA基因质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。A/duck/Anhui/D293/2014 (H3N2)、A/chicken/Shandong/16/05 (H9N2)、新城疫病毒(LaSota) 和鸡传染性支气管炎病毒(H12) 由本实验室分离和/或保存。H5N1 AIV、欧亚分支H7N2和H7N9病毒抗原，购自哈尔滨维科生物制品有限公司。

1.2 主要试剂 病毒RNA提取试剂盒，购自Roche公司；SYBR Green PCR Master Mix，购自Applied Biosystems公司；反转录流感特异性引物为Uni 12 :5′-AGCAAAAGCAGG-3′，由北京擎科新业生物技术有限公司合成；反转录试剂盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit′，购自Promega公司。

1.3 引物设计与合成 参照GenBank已发布的H7亚型AIV血凝素(HA)基因序列，利用MEGA 6和 Primer Premier 5.0针对北美源H7亚型AIV保守区域设计引物。引物序列分别为， F:5′-AATCACTAGGAGTCCAGAGTGATGC-3′；R: 5′-AGTTCTAGAGTTGATGTTTTGGAAT-3′，预期扩增片段115 bp。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.4 总RNA提取及反转录 使用Roche RNA提取试剂盒分别提取H3N2、H5N1、H7N2、H7N9和H9N2亚型流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的总RNA。按照试剂盒说明书进行反转录获得cDNA，用于PCR扩增。

1.5 重组质粒标准品的制备 A/New York/107/2003(H7N2) HA目的基因的PCR扩增、连接、转化和鉴定等均按照常规方法进行。阳性重组菌液由北京擎科新业生物技术有限公司进行序列测定。将鉴定正确的阳性菌液扩大培养，提取重组质粒，分光光度计测量重组质粒浓度，-20 ℃保存。

1.6 实时荧光定量PCR反应体系 在20 μL反应体系中加入 SYBR Green PCR Master Mix (2×)10 μL、引物F 0.5 μL、引物R 0.5 μL、模板2 μL，加双蒸水至20 μL。

1.7 标准曲线的建立 将构建的重组质粒进行10倍倍比稀释，取1.0×108- 1.0×103Copies/μL作为标准品，进行实时荧光定量PCR反应建立标准曲线，并设置阴性对照NTC。

1.8 特异性试验 用建立的实时荧光定量RT-PCR方法分别对北美H7N2 AIV HA质粒，及欧亚分支H7N2、H7N9、H3N2、H5N1和H9N2流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒进行检测，并设置阴性对照，以评价该方法的特异性。

1.9 敏感性试验 将北美H7亚型AIV A/New York/107/2003(H7N2) HA 质粒稀释至5.3×107Copies/μL，再依次进行10倍倍比稀释，作为模板进行实时荧光定量RT-PCR扩增，评价该方法的敏感性。

2 结果

2.1 标准曲线的建立 将重组质粒标准品进行10倍倍比稀释，以6个不同稀释梯度的标准品质粒作为模板进行荧光定量PCR 扩增，根据DNA 拷贝数和Ct值生成标准曲线。标准曲线中Ct值和标准质粒DNA 浓度间呈现良好的线性关系，相关系数(R2)为0.99，Y=-2.905 log C0+37.406。见中插彩版图1。

2.2 特异性评价 用建立的实时荧光定量PCR方法对北美H7N2亚型AIV A/New York/107/2003(H7N2) HA质粒，及欧亚分支H7N2、H7N9、H3N2、H5N1、H9N2亚型AIV、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒进行检测，并设置阴性对照。结果表明，针对北美H7N2禽流感HA质粒出现特异性的扩增曲线，其他病毒及阴性对照均未产生荧光信号，表明该方法有良好的特异性。见中插彩版图2。

2.3 敏感性评价 以10倍倍比稀释的北美H7亚型AIV HA 质粒作为模板，评价该方法的敏感性。结果显示，该引物能检测出的最低质粒浓度为53 Copies/μL。见中插彩版图3。

3 讨论

自2013年中国发现了全球首例人感染H7N9病例以来，我国每年冬春季都会出现一波人感染H7N9疫情。2017年H7N9病毒进一步发生变异，部分毒株对家禽呈现高致病性，而且2016-2017年的第5波疫情较往年出现更早，报告病例数显著增多[10]。同时，北美源H7N2、H7N3亚型流感病毒也多次引起人类感染发病，这些均提示我们应加强对该亚型流感病毒的监测。尽管我国自然分离到的H7亚型AIV均属于欧亚分支，但随着国际贸易的增加以及候鸟迁徙带毒的影响，北美源H7亚型AIV传入我国的风险日益增加，因此建立一种针对北美H7亚型禽流感病毒的快速检测方法具有重要意义。

本研究中，我们建立了针对北美H7亚型AIV HA基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。该方法Ct值与DNA浓度间呈现较好的线性关系，可信度高。此外，该方法仅针对北美H7亚型AIV HA 基因出现特异性的扩增曲线，而未检出欧亚分支H7亚型AIV H7N2和H7N9、其他亚型(H3、H5和H9)流感病毒以及新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒。检测方法的灵敏度可达53 Copies/μL，具有良好的特异性、敏感性。

SYBR Green I是一种结合于双链DNA 小沟中的荧光染料，其荧光强度的增加与双链DNA 的数量成正比[11]。我们在之前的研究中已经建立了针对北美H7亚型AIV HA基因的RT-PCR检测方法，该方法适合基层实验室应用[7]。传统的RT-PCR检测方法需要通过核酸电泳进行鉴定，整个过程至少需要3～4 h才能完成。本研究中通过SYBR Green I和引物所建立的实时荧光定量PCR方法，整个过程仅耗时1.5 h，是一种更加简洁、快速的检测方法。因此，根据实验条件与实验要求的不同，我们所建立的北美H7亚型AIV HA基因检测方法能够为监测北美源H7 亚型AIV入境传播提供准确、有效的工具。