中药体外抗PRRSV研究进展

袁 威， 李 展， 张 平， 刘 江， 刘 君， 姚 燕， 邓俊良

(1.毕节市动物疫病预防控制中心， 贵州 毕节 551700 ； 2.四川农业大学动物医学院 动物疫病与人类健康重点实验室 环境公害与动物疾病四川省高校重点实验室， 四川 成都 611130)

1 单味中药水提液体外抗PRRSV作用

1.1 单味中药水提液单独体外抗PRRSV作用 中药含有十分复杂的化学成分，一味中药临床应用多样。研究证实，许多单味中药水提液均有优秀的体外抗PRRSV的作用。王学斌等[1]研究证实，板蓝根水提液能较强抑制PRRSV体外增殖，对PRRSV的最小直接杀灭浓度为0.195 mg/mL，最小阻断浓度为0.097 mg/mL；黄芪水提液对PRRSV增殖的抑制作用较弱，对PRRSV的最小直接杀灭浓度为25 mg/mL，最小阻断浓度为12.5 mg/mL，表明黄芪和板蓝根均对PRRSV有显著的体外抑制作用。胡梅等[2]研究发现，在安全浓度范围内，连翘水提液、黄芪水提液和板蓝根水提液分别在0.125～0.980 mg/mL、0.975～1.960 mg/mL、和0.488～1.960 mg/mL对PRRSV的阻断作用显著，3种水提液分别在0.125～0.980 mg/mL、0.125～1.960 mg/mL和0.488～1.960 mg/mL对PRRSV的抑制作用显著；板蓝根水提液在0.488～1.960 mg/mL对PRRSV具有显著的杀灭作用。李丹等[3]研究黄芪、板蓝根、甘草、山楂、鱼腥草和青蒿6种中药水提液在细胞安全浓度范围内抑制PRRSV感染细胞的作用时发现，先加中药后接种病毒时，各中药浓度分别在3.125～12.5 mg/mL、0.391～3.125 mg/mL、0.391 mg/mL、0.782～3.125 mg/mL、0.196～1.562 mg/mL、0.196～1.562 mg/mL能显著(P<0.05)保护细胞；先接种病毒后加中药时，各中药浓度在3.125～12.5 mg/mL、1.562～3.125 mg/mL、0.391～1.562 mg/mL、0.391～3.125 mg/mL、0.196～1.562 mg/mL、0.196～3.1254 mg/mL均能显著抑制病毒增殖(P<0.05)；中药和病毒体外作用后加入时，板蓝根浓度在1.562～3.125 mg/mL、甘草浓度在0.782 mg/mL对细胞的保护作用达到显著水平(P<0.05)。试验结果表明，6种中药对病毒感染细胞均有一定的抑制作用，并呈一定的量效关系，其中阻断病毒吸附和进入细胞作用均显著；而鱼腥草抑制病毒的合成及释放作用较为稳定，板蓝根在1.562 mg/mL、3.125 mg/mL保护率最高；药物对病毒的直接杀灭作用较弱，其中板蓝根在1.562 mg/mL、3.125 mg/mL的作用比较明显。曾强等[4,5]研究板蓝根、甘草、鱼腥草的水提液发现，板蓝根粗提物对PRRSV和PRRSV PX株阻断的最佳质量浓度均为3.125 mg/mL，抑制PRRSV和PRRSV PX株的最佳质量浓度分别为3.125 mg/mL和1.563 mg/mL，直接灭活PRRSV和PRRSV PX株的最佳质量浓度分别为1.563 mg/mL和0.782 mg/mL；甘草粗提物阻断PRRSV和PRRSV PX株的最佳质量浓度分别为0.391 mg/mL和3.125 mg/mL，抑制PRRSV和PRRSV PX株的最佳质量浓度为分别0.782 mg/mL和0.391 mg/mL，直接灭活PRRSV和PRRSV PX株的最佳质量浓度均为0.782 mg/mL；鱼腥草粗提物质量浓度为0.782 mg/mL时，阻断、抑制PRRSV和PRRSV PX株感染效果最好，无直接灭活作用。刘樱等[6]研究发现，黄芪、板蓝根及青蒿这3种水提液中黄芪水提液对PRRSV感染Marc-145细胞的阻断作用最强；同时黄芪水提液对PRRSV的直接杀灭作用保护率为100%，且非常稳定；青蒿水提液在浓度较高时还有促进细胞生长的作用，但稳定性差，随浓度降低其保护率迅速下降；在对病毒的抑制作用试验中发现这3种水提液细胞保护率都能达到100%，甚至以上。田朝晖等[7]研究发现，青蒿水提液在不同浓度(1、2、4、6 μg/mL)作用下，青蒿水提液抑制 PRRSV所导致的细胞变性效果有显著差异，浓度越高，抑制效果越好，同时还能有效降低 PRRS病毒复制与抑制病毒导致细胞变性效果。赵凤柱等[8]报道，黄芩具有体外抗PRRSV的作用。徐端红等[9]制备莪术油观察在体外细胞上对PRRSV的作用效果发现，自最大安全浓度作倍比稀释后，莪术油注射液对PRRSV具有一定的抑制、杀灭和阻断作用，其中对PRRSV的杀灭作用较为突出。

1.2 单味中药水提液联合作用体外抗PRRSV作用 王学斌等[1]研究发现，板蓝根水提液和黄芪水提液混合后对PRRSV的体外抑制作用显著增强，混合水提液对PRRSV的最小直接杀灭浓度降为0.097 mg/mL，最小阻断浓度降为0.049 mg/mL，且对PRRSV致CPE抑制作用明显优于单味水提液。表明板蓝根、黄芪两种水提液体外联合使用对PRRSV具有较强的协同抑制作用，且能明显降低联合使用时各自对PRRSV的有效浓度。梅春升[10]研究证实，黄芪、黄芩和板蓝根与重组PoIFN-γ联合应用具有明显的协同抑制PRRSV作用，当0.030 mg/mL的黄芪、0.033 mg/mL的黄芩、0.173 mg/mL的板蓝根分别与25.84 IU/mL、27.7 IU/mL、28.22 IU/mL的重组poIFN-γ联合应用时，即可达到50%的病毒抑制率。联合用药降低了单味药物的用量，也提高了药物的抗病毒疗效。

由此得出，许多单味中药水提液在安全浓度范围内均表现出体外抗PRRSV的作用，并在一定浓度范围内呈一定的量效关系，其中以板蓝根水提液体外抗PRRSV作用较为突出，且多种中药水提液之间、中药水提液与γ干扰素之间联合应用体外抗PRRSV具有较强的协同作用，且能降低单味药物的用量，提高药物的抗PRRSV效果。

2 中药单体体外抗PRRSV作用

2.1 金银花单体 王学兵等[11]研究发现，在安全浓度范围内，金银花有效成分绿原酸对PRRSV具有显著的体外抑制和阻断作用，其对PRRSV的最小阻断浓度为0.097 7 μg/mL，最小抑制浓度为0.391 μg/mL，且阻断作用优于抑制作用，可知绿原酸在病毒生长早期起到明显预防病毒感染的作用。Cheng等[12]发现，绿原酸和黄芩素对PRRSV达到50%有效率的浓度分别为270.8 μg/mL±14.6 μg/mL和28.21 μg/mL±26.0 μg/mL，选择指数分别大于5.54和35.5，能抑制PRRSV的复制或直接杀灭PRRSV，在最大无毒浓度时对PRRSV的抑制率分别达到90.8%和61.1%，而对病毒的吸附没有作用。陈锋等[13]、刘利青等[14]研究发现，金银花和金银花枝叶提取物均具有良好的体外抗PRRSV活性，金银花提取物大孔树脂60%乙醇水洗脱部位在6.25 μg/mL～1.0 mg/mL对PRRSV具有良好的体外抑制作用；金银花枝叶提取物60%乙醇水洗脱部位对PRRSV感染细胞的最小保护浓度为6.25 μg/mL，60%乙醇水洗脱部位使PRRSV病毒滴度从105.8TCID50降低至100.3TCID50左右；同时发现绿原酸和芦丁的标准品对PRRSV的增殖和ORF1 mRNA的表达均没有抑制作用。因此表明金银花60%乙醇水洗脱部位的抗PRRSV的活性应该是其他的未知物质或者是多种化学成分共同发挥作用。绿原酸在最大安全浓度为500 μg/mL下可使Marc-145细胞免受PRRSV的侵染，同时明显降低凋亡细胞的数量[15]。绿原酸在最大安全浓度为250 μg/mL下能够有效增强3D4/2细胞的吞噬能力，増强TNF-α和IL-6的分泌同时抑制IL-10的分泌，抑制由PRRSV引起的3D4/2细胞凋亡[16]。

2.2 黄芪单体 胡梅等[2]研究发现，黄芪多糖在0.010 mg/mL～0.073 mg/mL对PRRSV具有显著的阻断和抑制作用。张红英[17]研究发现，黄芪多糖对PRRSV感染具有显著的阻断作用(0.391 mg/mL～0.049 mg/mL)，在较高浓度(0.196 mg/mL～0.391 mg/mL)时具有显著的直接杀灭作用(P<0.05)。王爱萍等[18]发现，黄芪多糖分别在0.078 mg/mL～1.25 mg/mL和0.156 mg/mL～1.25 mg/mL时体外对PRRSV具有明显的阻断和抑制作用，在1.25 mg/mL时体外对PRRSV具有一定的杀灭作用。刘樱等[6]研究发现，黄芪多糖在浓度为0.32 mg/mL时对PRRSV直接杀灭作用保护率为20%左右，黄芪多糖浓度为0.01 mg/mL时对细胞的保护率为24.30%。黄芪多糖在不同浓度(1、2、4、6 μg/mL)作用下抑制 PRRSV所导致的细胞变性效果有显著差异，浓度越高，抑制效果越好[7]。

2.3 板蓝根单体 张红英[17]研究发现，板蓝根多糖对PRRSV感染具有显著的阻断作用(0.024 mg/mL～0.196 mg/mL)和直接杀灭作用(0.048 mg/mL～0.196 mg/mL)(P<0.05)。王学兵等[19]研究发现，板蓝根多糖体外对PRRSV具有较好的阻断和抑制作用，其最小阻断浓度为2.094 μg/mL，最小抑制浓度为8.375 μg/mL。Wei等[20]发现，板蓝根多糖对PRRSV感染Mrc-145细胞的抑制作用呈剂量依赖性(10 mg/mL～80 μg/mL)，其中80 μg/mL板蓝根多糖处理后对PRRSV增殖抑制率将近99%；当40 μg/mL板蓝根多糖添加到PRRSV感染Mrc-145细胞前(6 h和3 h)、感染后(3 h和6 h)或与PRRSV同时添加发现，板蓝根多糖与PRRSV同时添加时能显著降低PRRSV滴度(P<0.05)，感染前添加效果也优于感染后添加，但是效果均不显著(P>0.05)；当板蓝根多糖与PRRSV直接作用后发现，板蓝根多糖能直接杀灭PRRSV，呈剂量依赖性，并在20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL时达到显著水平(P<0.05)；Mrc-145细胞感染PRRSV 1 h后添加板蓝根多糖处理4 h，24 h后检测发现病毒mRNA和蛋白质含量均呈剂量依赖性降低，其中80 μg/mL板蓝根多糖处理后病毒mRNA和蛋白质分别降低了57.6%和89%。刘樱等[6]研究发现，板蓝根多糖对PRRSV的阻断作用最强，在浓度为0.031 mg/mL时，对细胞保护率能达到48.03%；在浓度为0.01 mg/mL时，对细胞的保护率为24.57%。板蓝根多糖在不同浓度(1、2、4、6 μg/mL)作用下抑制 PRRSV所导致的细胞变性效果有显著差异，浓度越高，抑制效果越好，同时还具有一定的减少病毒造成细胞病变的作用[7]。

2.4 其他中药单体 张凤英等[21]报道，黄芩茎叶提取物干扰PRRSV在Marc-145细胞中增殖。张道广等[22]研究发现，黄芩多糖显示细胞水平抑制PRRSV增殖作用。张红英[27]研究发现，山药多糖在高浓度区(0.098 mg/mL～0.196 mg/mL)可以有效阻断PRRSV对细胞的感染作用。蒲秀英等[23]在贯叶连翘中提取的金丝桃素体外抗H-PRRSV活性的研究中发现，在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(H-PRRSV)感染的同时加入金丝桃素，其细胞存活率和对H-PRRSV的抑制率略有升高，与H-PRRSV对照组和拉米夫定对照组相比均有显著性差异；在H-PRRSV感染前和感染后加入金丝桃素，其细胞存活率和对PRRSV的抑制率明显升高，且随药物浓度的增加而上升。吴瑗等[24]发现，芦荟多糖在0.049mg/mL～0.391 mg/mL和0.196mg/mL～0.391 mg/mL对PRRSV有显著的阻断和直接杀灭作用(P<0.05)。Liu等[25]体外试验研究发现，牛膝多糖和硫酸化牛膝多糖分别在0.488 μg/mL～3.096 μg/mL和0.244 μg/mL～0.977 μg/mL对PRRSV有显著的抑制作用(P<0.05)，在0.488 μg/mL～3.096 μg/mL和0.244 μg/mL～0.488 μg/mL对PRRSV有显著的阻断作用(P<0.05)，在0.977 μg/mL～3.096 μg/mL和0.244 μg/mL～0.488 μg/mL对PRRSV有显著的直接杀灭作用(P<0.05)，且硫酸化牛膝多糖的体外抗PRRSV活性均优于牛膝多糖，说明牛膝多糖经过硫酸化能提高其抗PRRSV活性。Yang等[26]研究发现，粗茎鳞毛蕨(又称绵马鳞毛蕨)提取物黄绵马酸AB能通过抑制PRRSV对Mrc-145细胞的吸附、PRRSV的核酸注入、PRRSV核酸转录和翻译、PRRSV释放及诱导抗病毒细胞因子(IFN-α、IFN-β和IL-1β)的表达等多途径抑制PRRSV增殖。贺晶晶等[27]研究表明，花椒、沉香、卫矛和青黛4种中药的提取物在一定浓度范围内对PRRSV致Marc-145细胞CPE有明显抑制作用，其中卫矛提取物抑制作用最明显，这4种提取物分别在291.2 μg/mL～582.4 μg/mL、89.8 μg/mL～179.7 μg/mL、320.3 μg/mL～640.6 μg/mL和3 381.3 μg/mL显著抑制PRRSVORF7基因表达(P<0.05)。Li等[28]发现，乙酰基血根碱和苍术素醇对PRRSV有显著的抑制作用，其IC50分别为7.9 μmol/L和39.4 μmol/L，并呈剂量依赖性明显减弱ORF7基因的表达。陈志胜等[29]体外试验发现，穿心莲内酯在0.04 mg/mL～0.16 mg/mL能100%抑制PRRSV增殖，在0.02 mg/mL～0.16 mg/mL能100%直接杀灭PRRSV；芦根多糖在0.575 mg/mL时能100%保护细胞，阻断PRRSV吸附，在0.144 mg/mL～0.575 mg/mL能显著抑制PRRSV的增殖，在0.072 mg/mL～0.575 mg/mL能100%直接杀灭PRRSV；夏枯草多糖在0.070 mg/mL～1.125 mg/mL能100%阻断PRRSV对细胞的吸附，而抑制和直接杀灭作用较弱。刘樱等[6]研究发现，青蒿素在浓度为0.32 mg/mL时对PRRSV直接杀灭作用保护率都是20%左右；在对病毒的抑制作用试验中，青蒿素浓度为0.01 mg/mL时对细胞的保护率为26.20%。张玲等[30]以山豆根多糖作用于PRRSV体外感染8 h的RAW264.7细胞发现，200 μg/mL～400 μg/mL山豆根多糖能极显著升高PRRSV感染RAW264.7细胞存活率，有效降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平，从而有效干预PRRSV感染免疫细胞的炎性反应。表告依春在浓度为500 μg/mL时可使Marc-145细胞免受PRRSV的侵染，同时明显降低凋亡细胞的数量，而淫羊霍苷在浓度为31.25 μg/mL时不能完全防止PRRSV侵染Marc-145细胞，但可以减少受病毒侵染的细胞数目，并起到一定抑制细胞调亡的作用[15]。连翘酯苷A和表告依春分别在浓度为125 μg/mL、1 000 μg/mL下均能够有效增强3D4/2细胞的吞噬能力，増强TNF-α和IL-6的分泌，同时抑制IL-10的分泌，抑制由PRRSV引起的3D4/2细胞调亡[16]。吴倩倩[31]研究发现，在感染后48 h，原花青素和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在5 μg/mL～40 μg/mL的浓度范围内呈剂量依赖性地显著抑制PRRSV的增殖，在感染后6～48 h内的不同时间点，40 μg/mL的原花青素和EGCG均能有效抑制PRRSV的NSP9 mRNA和N蛋白的合成；原花青素和EGCG在5～40 μg/mL浓度范围对PRRSV的吸附、内化和释放的过程有明显的抑制效果，且呈剂量依赖性；而40 μg/mL的原花青素和EGCG对PRRSV的合成和组装阶段有显著的抑制作用；将药物与PRRSV直接作用发现，5～40 μg/mL的原花青素和EGCG均能使PRRSV感染Marc-145细胞的能力呈剂量依赖性下降。

由此得出，许多中药单体在安全浓度范围内均表现出多途径体外抗PRRSV或PRRSV PX株作用，且在一定浓度范围内呈剂量依赖性增强，中药单体经工艺修饰可提高其体外抗PRRSV效果。

3 复方中药水提液体外抗PRRSV作用

同样，有研究表明，复方中药对PRRSV有良好的体外抑制作用。沈国权等[32]采用细胞培养的方法测定了自拟药方抗病毒合剂(虎杖、女贞子、杠板归等10味中药组成)抵抗PRRSV感染细胞的作用。在46.88 μg/mL～6 000 μg/mL范围内对PRRSV的阻断作用显著，以93.75 μg/mL的作用最佳；在375 μg/mL～6 000 μg/mL范围内对抑制作用显著，以3 000 μg/mL的作用最佳；在46.88 μg/mL-6 000 μg/mL范围内对PRRSV的直接杀灭作用效果显著，以6 000 μg/mL最佳，表明抗病毒合剂具有较强的体外抗PRRSV作用，并呈一定的量效关系。顾文松等[33]将虎杖、女贞子、杠板归等中药提取物添加到细胞培养液中培养Marc-145细胞发现，在19.53 μg/mL～2 500 μg/mL范围内对PRRSV的阻断作用显著，其中39.06 μg/mL作用效果最好；在156.25 μg/mL～2 500 μg/mL范围内对PRRSV的抑制作用显著，以1 250 μg/mL效果最佳；在19.53 μg/mL～2 500 μg/mL范围内对PRRSV的直接杀灭作用效果显著，以2 500 μg/mL效果最好，表明中药提取物对细胞抵抗PRRSV感染有较强的作用，并呈一定的量效关系。吴金梅等[34]用柴胡解毒注射液体外培养Marc-145细胞发现，自最大安全浓度作倍比稀释后，柴胡解毒注射液对PRRSV均具有一定的抑制、杀灭和阻断作用，其中在55 μg/mL～7 000 μg/mL和220 μg/mL～7 000 μg/mL分别对PRRSV抑制和杀灭作用较为显著。李雪等[35]将圆蓝瘟毒康注射液和玉屏风散提取液体外培养Marc-145细胞后发现，两种中药复方对PRRSV感染均有显著的抗吸附作用，能够抑制病毒感染。赵翠莉[36]研究发现，2.0 mg/mL的千世杨(黄芪、黄连、黄芩、茶多酚、姬松茸多糖等20余种中药组合而成)提取物与PRRSV等量混合，37 ℃作用1 h可以将病毒杀灭，即2.0 mg/mL的千世杨提取物有较好的体外抗PRRSV作用。

由此得出，复方中药水提液在安全浓度范围内均表现出体外抗PRRSV的作用，且在一定浓度范围内呈剂量依赖性增强，复方中药水提液对PRRSV的阻断作用较抑制和杀灭作用强，阻断浓度范围更广。

4 总结

综上所述，无论是单味中药水提液、中药单体，还是复方中药水提液在安全浓度范围内均能表现出良好的体外抗PRRSV或PRRSV PX作用，且在一定浓度范围内呈剂量依赖性增强，不同中药种类、同一中药不同成分等均有不同的体外抗PRRSV作用，不同中药联合使用、同一中药经工艺修饰均能增强体外抗PRRSV作用。目前有关中药体外抗PRRSV的研究还有待加强，特别是中药体外抗PRRSV的作用机制，研究出更好的体外抗PRRSV中药，为更早投入临床应用提供依据。