单胃动物内源氨基酸损失的测定方法及影响因素研究进展

李 瑞 ，宋泽和 ，贺 喜 ,2*

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128；2.湖南畜禽安全生产协同创新中心，湖南长沙 410128）

饲料原料氨基酸消化率的精确测定是评估动物氨基酸营养需要和制定日粮配方的基础。众多研究表明，单胃动物小肠是氨基酸吸收、转运的主要场所，因氨基酸在大肠中的净吸收量较少，加之后肠微生物代谢活动，使得后肠食糜中的氨基酸组分发生了很大变化[1]。因此在单胃动物氨基酸消化率评定中，回肠末端真消化率因其有更好的可加性、合理性和准确性而被广泛采用。测定回肠末端氨基酸真消化率要求必须精准评估动物的内源性氨基酸损失。动物消化道中内源性氨基酸包括肠道分泌消化液（唾液、胃液、胆汁和胰腺分泌的酶等）、肠道脱落细胞和黏蛋白等[2]。内源氨基酸损失分为基础损失和特异性损失：基础损失和干物质采食量以及动物的代谢状态有关，与日粮的组成没有关系；而特异性损失与饲料的组成直接相关，日粮中蛋白质、纤维及抗营养因子等不同都会导致特异性损失的差异[1-2]。本文就单胃动物内源氨基酸损失的测定方法及影响因素进行综述。

1 内源氨基酸损失的测定方法

在畜禽营养研究中，常以回肠氨基酸消化率（Ileal Amino Acid Digestibility，IDAA）测定来评估日粮氨基酸有效性。畜禽IDAA可用表观回肠氨基酸消化率（Apparent Ileal Amino Acid Digestibility，AIDAA）、标准回肠氨基酸消化率（Standardized Ileal Amino Acid Digestibility，SIDAA）和真回肠氨基酸消化率（True Ileal Amino Acid Digestibility，TIDAA）表示。三者与回肠内源氨基酸损失（Ileal Endogenous Amino Acid Losses，IAAend）密切相联，IAAend包括基础IAAend和特殊IAAend，基础IAAend校正AIDAA得SIDAA，而总IAAend校正AIDAA为TIDAA。诸多研究推荐，饲料原料以SIDAA作为畜禽氨基酸营养需求和日粮配制参考，因为SIDAA测定相对简单，且具有可加性，可避免AIDAA缺乏可加性和TIDAA测定的复杂性（需要明确特殊IAAend）的不足。为此，针对内源氨基酸损失测定开展了大量研究，对具体测定技术和方法进行介绍。

1.1 无氮日粮法 无氮日粮NFD（Nitrogen-Free Diet，NFD）法是畜禽饲料及原料氨基酸消化率评定的经典方法。其假定畜禽内源性氨基酸为畜禽采食NFD后进入食糜或粪中的蛋白质和氨基酸，且内源性氨基酸的排泄量及氨基酸组成与日粮组成无关。然而，NFD法忽略了畜禽正常生理状态，畜禽采食NFD，消化道中的消化液和消化酶分泌会减少，流入后肠道蛋白总量也相应减少，因此会低估回肠末端内源性氨基酸的含量。另外，采食氨基酸缺乏的NFD会影响畜禽体内正常的蛋白质代谢，比如会导致回肠中脯氨酸和甘氨酸损失增加，可能与谷氨酰胺代谢成谷氨酸、脯氨酸等有关[3]。目前，NFD配制过程中常加入少量合成纤维和高可消化蛋白（如酪蛋白）来改善畜禽采食NFD后出现的异常生理状况[1]。

1.2 绝食法 绝食法通常应用于禽类研究，其中最为经典的动物模型是去盲肠成年公鸡，将绝食动物30～36 h排泄物中的氮和氨基酸记作内源排泄量，此法简单易行，且成本低。多数研究表明，采用绝食法测定动物内源氨基酸损失，其测定值偏低，不能代表动物正常采食条件下肠道内源氮排泄情况。这可能与绝食状态下，动物处于负氮平衡的非正常生理状态及缺乏饲料采食对消化道的刺激等有关。任立芹等[4]的研究结果发现，绝食组、强饲25 g和40 g NFD组黄羽肉鸡内源性氨基酸排泄量依次显著增加，可能是NFD刺激肠道导致内源性氨基酸的排泄量高于绝食组，且随强饲量增加而增加。

1.3 差量法 差量法认为动物内源性氨基酸排泄量随日粮蛋白质水平的升高而升高，达到阈值后在某一日粮蛋白质水平区间内出现1个平台期，并假定这一蛋白质水平区间的内源性氨基酸排泄量恒定。此法假定的恒定排泄量较NFD法和回归法更符合动物正常生理条件下的测定值。王国兴等[5]研究发现，差量法测得鸭日粮（蛋白水平在10%～20%）氨基酸真消化率和内源氨基酸排泄量值较恒定，测定值与NFD法、回归法和饥饿法相当，略高于饥饿法。

1.4 酶解酪蛋白法/超滤法 酶解酪蛋白法/超滤法即给动物饲喂含酶解酪蛋白（由分子质量小于5 ku的游离氨基酸和小肽组成）半纯合日粮，收集回肠食糜，上清过分子质量分离点为10 ku的超滤管，分子质量大于10 ku的超滤残留物与离心沉淀物混合用于内源性氨基酸测定；分子质量小于10 ku超滤液则是来自饲粮中未被消化吸收的外源性氨基酸。郭广涛等[6]报道，酶解酪蛋白法/超滤法的滤液中可能包含一部分低分子量的内源氨基酸和小肽，从而低估内源氨基酸的损失。而Yin等[7]在生长猪上采用酶解酪蛋白法测定40种饲料原料SIDAA时发现，酶解酪蛋白法测定的内源性粗蛋白和氨基酸损失较NFD测定值高，高估了内源氨基酸的损失，这可能与食糜中未被吸收的酶解酪蛋白产物有关。Golian等[8]用酶解酪蛋白法、NFD法和回归法测定肉鸡回肠氨基酸内源损失发现，NFD法与回归法测定结果相似，而二者与酶解酪蛋白法的测定值差异较大。虽然酶解酪蛋白技术测定回肠内源性氨基酸损失报道不一，但此法可直接测定全部种类的氨基酸和氮的内源量，相较15N同位素法和高精氨酸法具有明显优势。

1.5 回归法 回归法假定动物排泄物或消化道食糜中蛋白质（或氨基酸或回肠表观可消化氨基酸）总流量与氨基酸食入量间呈线性关系。采用一系列不同蛋白质水平的试验日粮饲喂动物，外推至摄入氮为零的日粮时，线性回归方程的截距即为内源氮和氨基酸的排泄量。理论上该法测定的内源氮或氨基酸损失较NFD法应具有更高的准确性，因为这种方法饲喂下，动物更趋向于正常生理状态下的采食。Spindler等[9]发现，对低蛋白含量的饲料原料采用回归法测定氨基酸消化率要优于NFD法。采用回归外法与NFD法测定氨基酸消化率差异不显著，且回归法较NFD法需要更多的日粮处理，试验操作较繁琐。Eklund等[10]报道，采用回归法测定棉粕猪SIDAA和氨基酸内源损失，除了甘氨酸和脯氨酸结果偏低外，其他氨基酸测定结果与NFD法测定值相近。可能原因有3个方面：①回归法、NFD法均认为不同日粮扣除同量内源性氨基酸；②回归法外推至食入蛋白质量为零时，近似于NFD法；③氨基酸摄入量与食糜中氨基酸总流量间不呈线性关系。

1.6 高精氨酸法 高精氨酸是一种人工合成、稳定的赖氨酸类似物，不用于动物体蛋白合成，日粮中的赖氨酸与甲基异脲发生胍基化反应生成高精氨酸，高精氨酸进入肝脏，在精氨酸酶催化下生成赖氨酸和尿素，而吸收的高精氨酸不会出现在肠道，因此，可被用来区分动物肠道内源性及外源性赖氨酸，从而测出内源性赖氨酸的流量，再根据动物肠道内源性氨基酸的组成相对恒定的这一条件，计算其他内源氨基酸流量[11]。张鹤亮等[12]采用NFD法、回归法、高精氨酸法测定生长猪回肠内源氨基酸流量，结果显示，回归法和NFD法低估了日粮内源氨基酸损失，高精氨酸法估计内源氨基酸损失较准确。事实上，日粮中蛋白质来源多样，动物内源性氨基酸组成模式存在差异，这极大限制了胍基化法的使用。同时，家禽由于缺乏将同型氨基酸转变为赖氨酸的酶，此法不能应用家禽营养研究。另外，高精氨酸测定技术在对受热损害的饲料蛋白质进行胍基化处理后，其代表性差，可导致对内源性氮估测误差[12]。

1.7 同位素法 同位素标记法是运用同位素示踪原理，借助稳定性或放射性同位素标记外源（日粮）或内源（动物）氮，进而区分排泄物或食糜中的外、内源氮，可直接对动物内源氨基酸排泄量进行估测。已报道的标记方法有13C、15N亮氨酸、15N异亮氨酸和15N同位素稀释技术[1,14]。在标记物选择上，因外源（日粮）氮标记只能选择可有效标记的蛋白源，且被机体吸收的标记氨基酸能迅速分泌入肠腔，使得食糜中未消化的日粮氮和内源氮无法区分，而内源标记（动物）可测定采食条件下动物内源氨基酸排泄量；另外，通过标记物15N亮氨酸的转氨基作用，标记其他氨基酸，进而直接测定其他氨基酸排泄量，因此采用标记动物的方法较为理想。同位素内源（动物）标记基本原理：静脉连续灌注15N标记物7～10 d，标记内源氮前体池，当15N标记物在体内各部位达到平衡状态后，消化道内源氮损失量中15N富集度与血浆游离氨基酸中15N富集度相同，进而通过相应公式换算得出内源氨基酸排泄量。

2 影响内源氨基酸损失测定的因素

2.1 动物因素

2.1.1 动物种类、日龄或体重 配制畜禽日粮时，禽类氨基酸营养标准参照NRC 1994，而猪氨基酸营养标准参照NRC 1998和NRC 2012，不同种类动物氨基酸需要不同，说明动物种类差异决定其内源氨基酸损失必然存在差异。与此同时，动物日龄或体重也影响动物内源氨基酸损失，这可能是由于不同体重或日龄的动物生理成熟度有差异。Adedokun等[15]发现，5日龄肉仔鸡回肠内源氨基酸损失是15日龄时的2倍，这与肉仔鸡肠道发育存在差异有关。Leterme等[16]报道，随着猪体重的增加，内源氮和多数氨基酸的排泄量呈线性增加，而单位干物质采食量（DMI）氨基酸的总和以及多数氨基酸的内源损失曲线下降。Presto 等[17]研究也发现，体重为25.9 kg猪的所有必需氨基酸和非必需氨基酸的内源损失量均高于93.2 kg的猪，计算得到的回肠氮损失分别为1.411、0.86 g/kg DMI。

2.1.2 动物采食量 动物采食日粮会刺激消化道，而消化道中的消化液、消化酶、脱落细胞及黏蛋白均是内源氨基酸的组成成分，因此采食量会影响动物内源氨基酸损失。Thompson等[18]报道，肉鸡绝食24 h，小肠绒膜形态发生显著改变，黏液减少46%。Smirnov等[19]也发现，4周龄的肉鸡绝食和水72 h，肠道表面的黏液层厚度降低。Moter等[20]研究发现，随着日粮采食量的增加，生长猪内源氨基酸的排泄量呈线性增加，单位采食量对应的内源蛋白和大部分氨基酸损失线性减少。

2.1.3 肠道黏膜更新速率与肠道健康 动物肠道黏膜更新伴随着黏蛋白合成与分解，由于更新速率不同，动物内源氮或氨基酸排泄量将呈动态变化。研究发现，影响肠黏膜更新速率的因素主要包括日粮、日粮氨基酸水平、肠道微生物等，因为日粮进入动物肠道会刺激消化道黏蛋白分泌，氨基酸可为黏蛋白合成提供原料，而肠道微生物可附着在肠黏膜相应位点上，还可分解利用后肠段黏蛋白[21]。同样，动物肠道健康也是影响其内源氮或氨基酸排泄量的关键因素。Adedokun等[21]报道，肠道微生物可促进动物十二指肠和回肠的更新，而病原菌的入侵会加剧更新。Collier等[22]研究发现，肉鸡感染产气荚膜梭菌，肠黏膜更新速率加快，黏蛋白分泌增加，出现肠坏死现象。

2.2 日粮因素

2.2.1 日粮蛋白和氨基酸 日粮蛋白水平或氨基酸通过增加动物肠道消化酶的分泌和黏蛋白更新来影响内源氨基酸损失。Adedokun等[23]发现，增加肉鸡和火鸡日粮中酪蛋白水平，肠道内源氨基酸排泄量增加。这可能是由于增加日粮蛋白质水平刺激消化道分泌黏蛋白和促进了消化酶的分泌。另外，平衡日粮氨基酸会减少动物内源氨基酸或氮的排泄量。Nitrayová 等[24]采用NFD+氨基酸模式研究生长猪内源氮损失，结果发现，不添加氨基酸的NFD内源氮损失较大，而添加氨基酸组内源氮损失较小，且随着氨基酸添加比例的增加，内源氮损失有下降趋势。这说明日粮氨基酸模式越接近平衡，采食NFD的动物体蛋白分解等代谢活动越慢，内源氨基酸和氮损失就越小。此外，日粮蛋白结构也会影响动物内源氮或氨基酸损失[25]。

2.2.2 日粮纤维 研究表明，日粮纤维含量与纤维类型会影响肠道黏蛋白分泌、黏液组成、肠道食糜黏性和食糜在肠道的滞留时间等，同时日粮纤维的持水性、发酵性等特性会引起肠道内容物物化特性变化，影响动物内源氮和氨基酸的损失[1]。Kluth等[26]报道，高纤维含量的日粮可增加肉鸡内源氨基酸损失，但对内源氨基酸的组成没有影响。Mariscal-Landín等[27]发现，中性洗涤纤维增加了生长猪回肠氨基酸和蛋白损失，但对IDAA没有影响。

2.2.3 抗营养因子 日粮中的抗营养因子对蛋白或氨基酸消化率有负面作用。饲料中较常见的抗营养因子主要有非淀粉多糖（Non-Starch Polysaccharides，NSP）、蛋白酶抑制剂、植酸、单宁等，这些抗营养因子主要通过影响内源酶的分泌、肠道细胞的脱落及黏蛋白的产生来影响内源氮和氨基酸损失[21,28]。NSP不能被单胃动物肠道消化、吸收，其会影响食糜理化性质和营养物质的消化吸收。马秋刚等[29]试验发现，纤维素或果胶不同程度抑制了生长猪氨基酸消化率，而淀粉对其影响较轻。蛋白酶抑制剂可与蛋白酶的必需基团结合，在动物肠道抑制消化酶活性，引起消化腺组织增生[28]。单胃动物体内缺乏植酸酶，植物性饲料中的植酸酶不能有效降解，而植酸能螯合蛋白、消化酶和矿物质等，影响内源蛋白代谢和黏蛋白的分泌。研究发现，植酸会促进肠道黏蛋白分泌，增加内源氨基酸损失，添加植酸酶可促进回肠植酸降解，提高回肠粗蛋白质和氨基酸消化率[30-31]。

2.3 饲养环境与应激 动物所处环境的清洁度、温度及动物受到应激状况均会影响机体营养素的周转代谢，进而影响内源氨基酸的损失。Floc'h等[32]报道，猪舍卫生条件差会导致仔猪肠道发生炎症反应，影响机体色氨酸代谢和生理功能，这可能因卫生条件差，易滋生病原微生物，导致动物感染病原菌，损害肠道健康。仲菊等[33]研究发现，低温（8℃）、常温（24℃）和高温（30～32℃）组肉鸡36 h总内源氨基酸排泄量随温度升高而呈下降趋势，分别为785.5、534.5、395.23 mg/只，尿酸、氮沉积率和氮平衡值受温度影响极显著，高温组的表观代谢能值显著高于低温组，说明温度影响肉鸡机体氮代谢，低温条件下机体氮损失增加。Morales等[34]研究发现，热应激条件下（24～45℃），生长猪必需氨基酸消化率受到不同程度的影响，尤其是精氨酸和组氨酸影响程度较大，除脯氨酸的内源损失升高外，其他氨基酸的内源损失无影响，且内源蛋白组成没有变化，可能是猪对热应激的适应性较好，而低温可能对内源损失的影响更大。此外，免疫刺激因素也影响动物内源氮或氨基酸排放[35]。

2.4 其他因素 除上述介绍的影响因素外，饲料加工工艺、饲料添加剂及测定方法等因素也会影响动物内源氨基酸损失。Loar等[36]报道，制粒温度会影响去盲肠公鸡日粮氨基酸消化率，相较于74℃制粒日粮，85℃和96℃制粒日粮的肉鸡蛋氨酸、异亮氨酸和脯氨酸消化率显著降低，这可能与制粒过程中饲料原料间的养分（还原性糖类与氨基酸或蛋白质）发生美拉德反应有关。雷挺等[37]研究发现，饼粕类饲料原料中添加果胶酶可提高原料肉鸡回肠氨基酸消化率，一方面添加外源酶可补充内源酶不足，刺激内源酶分泌，促进养分消化吸收；另一方面，果胶酶有助于破除植物原料细胞壁，消除抗营养因子，提高饲料原料饲用价值。张鹤亮等[12]研究结果显示，回归法和NFD法低估了饲粮内源氨基酸损失，而高精氨酸法较准确。

3 小 结

SIDAA的测定已被广泛应用于单胃动物氨基酸营养需要研究和日粮配方设计中，因此，准确测定氨基酸内源损失至关重要。综合分析众多研究文献发现，NFD法较为常用，且可行度较高，已被广泛应用于氨基酸消化率评定，良好的NFD配方设计有利于试验结果更接近理论值。在测定方法的探索中，针对影响试验测定值的诸多因素开展了大量试验研究，但各因素具体的影响机制还有待于进一步验证。为此，开展内源氨基酸损失测定及相关影响因素的作用机制研究将有助于进一步精准确定动物氨基酸营养需要。

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