CCL18结合CCR8受体对膀胱癌5637细胞增殖和侵袭的影响

程新富　傅斌

【摘要】 目的：探討CCL18与CCR8受体结合对膀胱癌5637细胞增殖和侵袭的影响，为抑制膀胱癌迁移提供实验基础。方法：检测不同浓度CCL18下膀胱癌细胞中EMT部分标志物的蛋白表达变化。通过转染siRNA沉默CCL18的受体CCR8以研究对膀胱癌的生物学行为的影响及产生的相关变化，并进一步观察细胞形态、侵袭能力、肿瘤转移的相关变化情况。结果：在不同浓度CCL18处理下，E-cadherin随CCL18浓度增加其蛋白表达下调，而MMP-2、VEGF随CCL18浓度增加其蛋白表达上调。沉默CCR8受体后检测膀胱癌细胞连接变松散，细胞形态相对较圆；CCR8、MMP-2、VEGF-C的mRNA及蛋白表达水平下调，E-cadherin的mRNA及蛋白表达水平上调；transwell结果（200倍镜下）显示膀胱癌细胞数显著减少，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：CCL18通过结合CCR8受体促进膀胱癌细胞的增殖与侵袭。

【关键词】 膀胱癌； CCL18； CCR8受体； 细胞增殖

Effect of CCL18 Combined with CCR8 Receptor on Proliferation and Invasion of Bladder Cancer Cell Line 5637/CHENG Xinfu，FU Bin.//Medical Innovation of China，2017，14（35）：028-032

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of CCL18 combined with CCR8 receptor on proliferation and invasion of bladder cancer cell line 5637，and to provide an experimental basis for the inhibition of bladder cancer migration.Method：The expression of some EMT markers in bladder cancer cells under different concentrations of CCL18 was detected.Changes by transfection of siRNA silencing CCL18 receptor CCR8 in order to study the biological behavior of bladder cancer and the further observation of cell morphology and invasion related changes，tumor metastasis.Result：At different concentrations of CCL18，the expression of E-cadherin was down regulated with the increase of CCL18 concentration，while the expression of MMP-2 and VEGF was up-regulated with the increase of CCL18 concentration.Loose connection detection of bladder cancer cells after silencing CCR8 receptor，cell morphology was relatively round.mRNA and protein expression of CCR8，MMP-2 and VEGF-C levels were down regulated expression of mRNA and E-cadherin protein level increased.Transwell results（200 magnification） showed that bladder cancer cell number was significantly reduced，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：CCL18 combined with CCR8 receptor can promote the proliferation and invasion of bladder cancer cells.

【Key words】 Bladder cancer； CCL18； CCR8 receptor； Cell proliferation

First-authors address：Jingdezhen Second Peoples Hospital，Jingdezhen 333000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.35.008

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和肿瘤浸润树突状细胞（TIDCs）分泌的CCL18趋化因子是促进多种浸润性发展的重要原因[1-3]。利用膀胱癌与不同浓度梯度的CCL18与共培养，转染siRNA以沉默膀胱癌细胞上CCL18的受体CCR8后与CCL18共培养的方法观察其对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响。结合2015年3月-2016年5月CCL18结合CCR8受体对膀胱癌5637细胞增殖和侵袭的影响研究情况，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人膀胱癌5637细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，CCL18重组人蛋白购自美国Perprotech公司，多克隆兔抗人CCR8抗体购自武汉博士德生物公司工程有限公司，CCR8（human）及CCR8 siRNA、Lipo2000和E-cadherin、MMP-2、VEGF-C引物均由invitrogen公司构建合成，Matrigel胶购自BD公司，E-cadherin一抗购自CST公司，MMP-2一抗及VEGF-C一抗购自Anbo公司，RIPA 裂解液购自美国Sigma公司，RPMI 1640培养液和胎牛血清购自美国HyClone公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司，TRIzol reagent、DEPC购自invitrogen公司。在PrimerBank中根据相关引物需要查找相应的引物，选取100～200对碱基对之间的引物送invitrogen公司构建。endprint

1.2 方法

1.2.1 用6孔板接种膀胱癌5637细胞2×105个细胞/孔（约2 mL），培养12 h后。未加CCL18设为对照组（A组）；首先接受20 ng/mL的预处理多克隆兔抗人CCR8抗体4 h，然后50 ng/mL CCL18处理（B组）；接受50 ng/mL CCL18处理为（C组）；接受100 ng/mL CCL18处理为（D组），继续培养36 h后。western blot检测E-cadherin、MMP-2、VEGF-C蛋白表达变化情况。

1.2.2 细胞种板后分组：SC组（即实验组）转染CCR8 siRNA；NC组（即阴性对照组）转染非特异性脂质体；CC组（即空白对照组）未经任何处理。实验各组全部添加50 ng/mL CCL18，做培养处理。经过6 h，放置在荧光显微镜下，对荧光细胞数进行观察，转染效率=（荧光细胞数/同一视野白光下的细胞总数）×100%。

1.2.3 收集转染24、48、72 h后以上各组细胞，使用TRIzol试剂及Invitrogen试剂，将总RNA提取出，RNA浓度的测定使用超微量分光光度仪。使用TAKARA试剂盒、qRT-PCR Mix试剂盒进行qRT-PCR反应，以荧光定量PCR仪检测，各样品将内参照用作β-actin基因（Actin即“肌动蛋白”，属于细胞重要骨架蛋白），提取且反转录以上各组细胞的总RNA，生成cDNA，以cDNA作母版，使用2×EasyTaq PCR SuperMix来扩增PCR，循环40个。PCR以大幅增加微量DNA为最突出表现特征。

1.2.4 取上述各组样品上样20 μg，上样完毕后，用western blot以β-actin为内参照分别检测E-cadherin、MMP-2、MMP-9 、CCR8的蛋白表达量。

1.2.5 Transwell检测细胞侵袭力的改变，选择24孔板和与其相称的侵袭小室，将转染48 h后的细胞加放其中，孵箱培养16 h后洗涤固定，于显微镜下观察细胞侵袭情况，拍照并统计每视野细胞数量。

1.3 统计学处理 所有数据均使用统计学软件SPSS 20.0进行处理，用单因素方差分析进行检验，分析组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在不同浓度CCL18处理下，E-cadherin隨CCL18浓度增加表达下调，而MMP-2、VEGF随CCL18浓度增加表达上调，见图1。

2.2 转染后各组膀胱癌5637细胞在显微镜下可见：SC组相对于NC组和CC组，细胞连接变松散，细胞形态变的较其他两组相对较圆。SC组转染48 h细胞转染率最好，绿色荧光下细胞比例达85%，转染率约85%。见图2。

2.3 转染各组膀胱癌5637细胞后采用qRT-PCR检测结果显示：SC组细胞CCR8、MMP-2、VEGF-C的mRNA表达水平较CC组均显著下调，差异均有统计学意义（P<0.05），而NC组和CC组比较差异无统计学意义（P>0.05）；SC组细胞E-cadherin的mRNA表达水平较CC组上调，且差异有统计学意义（P<0.05），而NC组和CC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

2.4 转染各组膀胱癌5637细胞后采用western blot检测结果显示：以β-actin作为内参，与CC组比较，SC组CCR8、MMP-2、VEGF的蛋白表达下调（P<0.05）；E-cadherin的蛋白表达上调（P<0.05），而NC组CCR8、E-cadherin、MMP-2、VEGF-C的蛋白表达与CC组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图4。

2.5 转染各组膀胱癌5637细胞后transwell结果显示：与CC组比较，SC组细胞数显著减少，差异有统计学意义（P<0.05）；而NC组和CC组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。

3 讨论

CCL18是趋化因子家族中的一员，于1997年被不同研究组发现，在机体炎症反应和免疫应答等方面发挥了重要的作用[4]，目前有关炎症与肿瘤存在相互联系的假说已经逐步得到多方面证实[5-6]，CCL18诱导肿瘤细胞生长、迁移及转移。从实验来看，CCL18与肿瘤受体情况的关联性不明显，表明其并未参与肿瘤细胞受体合成。利用Kaplan-Meier生存分析获得，CCL18高表达组具有相对较差的预后，表明CCL18表达受乳腺癌生长及转移影响，提示CCL18能应用在乳腺癌预后因素的评估中。CCL18对不同肿瘤相反作用让大家认识到，CCL18调控肿瘤发生发展机制并不简单。CCL18对各肿瘤组织，会利用不同的信号通路凸显不一样的生物学功能。而有关CCL18在肿瘤中异常表达原因深入探究的实施，不断构建了其上下游调控网络，CCL18于肿瘤发生发展作用机制将更加明朗，科学引导CCL18为靶点的分子治疗。多种分子中的趋化因子在这些年用在许多体外实验中。Th1、Th2细胞能表达不一样的趋化因子受体，其参与细胞募集，同时定位在感染部位，其中CCR8主要作用Th2细胞，其配体为Ⅰ-309CCR8结合Ⅰ-309，能阻碍细胞凋亡。实验室使用的人膀胱癌5637细胞，具有较高的干细胞样细胞比例，从细胞结果得出，便于提示其在干细胞中的潜在作用。

有学者在研究中发现：肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和肿瘤浸润树突状细胞（TIDCs）分泌的CCL18趋化因子是促进肺癌、乳腺癌、结肠癌等癌细胞浸润性发展的重要原因，且初步表明肿瘤转移与相关趋化因子的浓度有一定相关性。

膀胱癌多发于泌尿生殖系统，属于一种恶性肿瘤。当前膀胱癌致病率及致死率于国内呈现高发态势，主要致死原因是癌症侵袭、复发与转移，严重地危害着我国居民健康[7]。文献[8-10]证实TAMs数量过多降低了非肌层浸润性膀胱肿瘤对卡介苗灌注疗法的疗效，并增加复发率；而在肌层浸润性膀胱肿瘤中，TAMs的数量显著性高于非肌层浸润性肿瘤，显著增加膀胱癌细胞远处转移、血管浸润的能力，患者5年存活率显著降低，TIDCs的出现强烈提示处于Ta/T1期的膀胱肿瘤患者将向肌层浸润性膀胱肿瘤发展，并影响膀胱肿瘤细胞对卡介苗灌注疗法的敏感性[11]。由此可见，TAMs与TIDCs会促进膀胱肿瘤复发与浸润性发展。CCL18通过结合肿瘤细胞的G蛋白偶联受体激活多种信号通路促使细胞骨架重建，同时促进肿瘤细胞发生上皮-间质转化（EMT）[12]，而EMT会促进膀胱癌浸润性发展[13]。而CCL18在膀胱癌患者尿液与组织中被发现有显著升高[14]。这些均表明CCL18与膀胱癌的浸润性发展密切相关。所以，提升本病认识，尽早实施相关病原学检测，有助于及时诊治及预防[15-19]。endprint

通过不同浓度CCL18与膀胱癌细胞共培养与沉默膀胱癌CCL18受体CCR8后检测膀胱癌细胞的生长状态、侵袭能力的变化及相关EMT相关标志物的表达，结果显示，膀胱癌细胞的生长及侵袭能力与CCL18浓度呈正相关，CCL18与膀胱癌细胞CCR8受体结合后促进了其生长及侵袭。基于超过25%的现有靶向治疗药物的作用靶点是直接或间接作用于G蛋白偶联受体，改善预后[20-21]，因此，该研究有望为膀胱癌的治疗提供新的药物靶点。

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（收稿日期：2017-11-15） （本文编辑：程旭然）endprint