血清4型禽腺病毒研究进展

朱庆贺，张鹏宇，王观悦，王 爽，陈 曦，杨旭东，史同瑞∗

（1.黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔161000；2.黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆163000）

4型禽腺病毒（Fowl avianadenovirus serotype 4，FAdV-4）主要是以心包积水为主要临床症状的鸡急性传染病，临床中又称为“鸡心包积水综合征（Hydropericardium syndrome，HPS）”。 该病发病急，传播速度快，主要引起4～8周龄肉鸡感染，死亡率可达40%～90%。该病最早于巴基斯坦的安卡拉被报道，由此又成为“安卡拉病”。近年来，我国河南、山东、安徽、辽宁、吉林、江西和湖北等省份出现大面积爆发，给我国养鸡业造成了严重的经济损失。本文综述了目前FAdV-4的相关研究进展，希望能为FAdV-4的进一步研究以及临床防控提供参考。

1 病毒分类、结构和理化性质

腺病毒科（Adenoviridae）因最初从腺体组织分离，故名腺病毒，而根据形态结构、免疫学特性和宿主范围可划分为两个属：哺乳动物腺病毒属（Mastadenivirus）和禽腺病毒属（Avianadenovirus）。禽腺病毒属根据其抗原性的不同可分为3个群。FAdV-4隶属于腺病毒科禽腺病毒属Ⅰ亚群，亚群已鉴定了5个禽腺病毒种，其名称用字母A～E表示，根据其血清型测试分为12个血清型。FAdV-4属于禽腺病毒C种血清4型。病毒粒子无囊膜，直径70～90 nm，呈 20面体对称，由衣壳（Capsid）、纤突（Fibre）、核酸芯髓（Core）及相关蛋白构成。其衣壳由252个壳粒（Capsomere）组成，其中20面体顶角上为12个五邻体（Penton），每个五邻体有两条纤突，长100A-370A，直径2 nm，纤突由五邻体蛋白为基底在衣壳表面伸出，纤突顶端形成头节区（Knob）。头节区可与细胞表面的病毒受体结合。其余240个非顶角壳粒为六邻体蛋白（Hexon）构成20面体的面和棱的大部分，六邻体成棱柱状，直径7～11 nm。病毒粒子在感染细胞核内经常呈晶格状排列。病毒核酸为双股DNA，占据整个病毒的11.3%～13.5%［1］。 病毒对脂溶剂，如乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠、胰蛋白酶、2%酚以及50%乙醇等具有抵抗力，同时可耐受pH3-9，但在浓度1∶1000的甲醛中可被灭活。另外，病毒的增殖也可被DNA抑制剂 BuDR 所抑制［2］。

2 流行病学

FAdV-4感染主要以鸡包涵体肝炎和心包内出现淡黄色透明液体为主要临床症状，因此也被称为HPS。HPS最早在巴基斯坦靠近卡拉奇的安卡拉首先被报道［3］。其后，在土耳其、斯洛伐克、印度、墨西哥、秘鲁、俄罗斯、孟加拉国、韩国相继出现该病［4］。 2006 年第一次在中国被报道［5］， 但 直 到2015年7月开始在中国的河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、新疆、安徽、山东、江西、湖北和江苏等省份迅速传播［6-7］。该病主要发生在炎热、湿润的夏季，但其他季节也可零星发生，发病率和死亡率可高达40%～90%。疾病主要4～8周黄羽肉鸡中爆发，2～3周龄偶发，通常经过一个24～48 h的潜伏期。特征性症状为心包出现淡黄色透明液体，肝脏肿胀，肾脏水肿，尿酸盐沉积。通过扩增中国分离的12株FAdV-4 Hexon基因并遗传进化树分析序列显示这些毒株可能来源于之前的印度株［8-9］。

测序结果表明，FAdV-4中国株与澳大利亚、墨西哥、加拿大的 KR5、ON1、MX-SH90对比分析显示存在ORF19基因缺失。已有研究证明，ORF19基因缺失毒株比ORF19完整毒株具有更高的致病性，ORF19基因的缺失也被认为是FAdV-4在中国造成大量流行的主要原因［10］。另外，还发现这些2015年分离的FAdV-4中国株与2013年分离的中国株的ORF29基因出现了33 nt和6 nt的基因缺失，可能暗示近年来爆发的FAdV-4株适应了中国的宿主和环境［11］。

最近报道称，在麻鸭中发现了FAdV-4发生，病毒感染25日龄麻鸭，病鸭呈现出与心包积液病鸡相似的临床症状，死亡率达40%［12］。然而，雏鸭并未出现死亡情况。另外，鸵鸟中也有Ⅰ群禽腺病毒分离的报道，利用12种标准毒阳性血清鉴定，确定分离株为FAdV-4，血清鉴定结果也与基因系统进化树分析相符合［13］。利用基因序列分析进行流行病学数据调查对于阐述FAdV-4在不同宿主之间进化关系，以及FAdV-4的预防和控制具有重要意义。

3 发病特征

已有研究证明，纯化的FAdV-4毒株攻毒SPF雏鸡24～48 h后可引起死亡，病鸡表现精神沉郁，闭目嗜睡，出现临床症状24 h内死亡，剖检可见明显的心包积液症状。不同的肉鸡毒株在田间呈现相似的敏感性。鸡胚卵黄囊接种FAdV-4出现鸡胚发育迟缓，出血，最终以胚胎死亡而告终。研究人员通过皮下注射，口服的方式均能复制出HPS［14］，FAdV-4对肉鸡表现出很强的致病性，在临床中能够横向通过粪便途径在鸡群甚至农场间传播。在产蛋母鸡被感染后，其后代可能出现先天性感染，进一步促进了病原的广泛传播。

野生鸟类FAdV-4抗体检测结果显示，乌鸦和鸽子的血清样本的阳性率较高，这表明野生鸟类可能是病原的携带者［15］，在自然条件下可能成为疾病传播的特定宿主。另外，有研究表明，FAdV-4毒株对淋巴组织有偏好，能够导致B、T细胞的耗竭，从而导致免疫抑制［16］。而HPS发生时常常伴发其他病毒如传染性法氏囊（IBD）及鸡传染性贫血病毒（CIA）的感染，这可能与其免疫抑制有关［17］。

4 诊断方法

4.1 临床及病理诊断 临床中4～8周龄的肉鸡死亡率较高。对濒死鸡分析表明，受感染病鸡精神沉郁，24 h内突然死亡，外观没有明显的临床症状，剖检可见心包内出现一种淡黄色透明液体，肝脏肿胀，偶尔可见肾炎症状。病理组织切片分析显示，攻毒试验鸡出现心肌淋巴细胞浸润，肝脏中肝细胞坏死及出现嗜碱性核内包涵体，其中嗜碱性核内包涵体可作为FAdV-4感染的典型特征［18］。

4.2 病毒分离 病鸡肝脏是主要的感染相关器官，病毒载量最高。因此，FAdV-4可以通过受感染的肝脏组织悬液接种鸡胚尿囊腔或卵黄囊的方式进行分离和纯化，也能在鸡胚胎肾细胞、鸡胚胎肝细胞、鸡胚成纤维细胞以及鹌鹑成纤维细胞（QT-35）上分离［19］，细胞感染后呈现明显的细胞病变，细胞脱落，感染细胞内存在包涵体。经纯化的病毒在透射电镜下与肝脏组织切片具有相同的形态学特征。

4.3 电镜 利用电镜可以对病毒、细菌、原生动物和真菌进行超微结构检查，在微生物的诊断中起着至关重要的作用，从受感染动物的血液、体液或组织中观察到病毒粒子存在是确诊病毒感染的金标准，通过对HPS病例中肝脏匀浆、肝细胞或病毒颗粒进行染色，利用透射电镜可以观察纯化后的腺病毒粒子，说明FAdV-4是HPS的致病病原［20］。在受感染的肝细胞核中观察病毒颗粒直径约75 nm，无囊膜、六边形、二十面体等典型特征，有助于对该病进行确诊。

4.4 分子生物学技术 分子生物学实验技术是实验室诊断最常用的检测方式。如限制性内切酶分析（REA）、DNA探针原位杂交、聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量 PCR［21］和高分辨率熔解曲线（high-resolution melting，HRM），均可用于FAdV-4的检测和鉴别。

酶切分析（REA）REA最初用于对FAdV不同毒株进行分组和鉴别。根据DNA的基因组相似性通过BamHⅠ和HindⅢ消化后，可从17株FAdV中得到11种血清型［22］。虽然FADV-4型和10型之间存在交叉中和，但利用 HindⅢ、DraⅠ、XbaⅠ、NotⅠ、SfiⅠ、BglⅡ、SmaⅠ和NaeⅠ酶切分析能够揭示其中的差异［23］。PCR方法是检测FAdV-4的最常用的方法。禽腺病毒PCR检测的主要优点是快速、简便、灵敏度高。Hexon基因常被研究人员用来设计引物，通过测序分析可将病毒的A～E种区分开来，并定位到种内特定的血清型［24］，通过PCR结合REA的方法可以检测和分化12株FAdV的参考菌株［25］。此外，Fiber基因因为其编码特定类型的亚基因中和表位也被用于禽腺病毒的检测。应用Alu I.氏酶能够建立针对Fiber基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）方法，可用于鉴别出现心包积液症状与不出现心包积液症状的 FAdV-4 毒株［26］。

利用荧光定量PCR方法可以达到检测和量化FAdV-4的目的。以Hexon基因L1区设计引物，可建立一种HRM-curve检测方法，用于FAdV-4的基因检测和血清分型［27］。

4.5 血清技术 琼脂扩散试验作为一种经典血清学检测方法，也被用于检测FAdV-4，该方法操作简便，实验要求较低，适于较为简单的临床及实验室检测。

FAdV-4不具备使鸡、大鼠以及小鼠红细胞凝集的能力，但Manzoor S利用人O型红细胞血凝抑制试验检测了野生鸟类中FAdV-4血清抗体情况［15］，得到了很好的试验结果。当然，最准确的诊断手段依然是病毒的中和试验（VN），但试验要求较高，费时费力且价格比较昂贵。

ELISA检测是FAdV-4血清学诊断的重要方法，早期研究中应用全病毒包被抗原检测自然感染和试验感染的鸡血清样本中FAdV的抗体。但是病毒抗原的制备相对繁琐且效率低下，敏感性和特异性较低。后期研究人员利用Hexon蛋白具备抗原决定簇的特点，利用FAdV-4的Hexon蛋白包被抗原，建立了FAdV-4的抗体检测方法，但由于Hexon蛋白是群禽腺病毒的群特异性抗原，可能影响血清型特异性的鉴别［28］。因此，研究人员利用FAdV-4的Fibre蛋白进行表达并作为包被抗原，能够做到针对4型禽腺病毒检测的目的［29］，另外，非结构蛋白100K、33K等也都有成功表达并做为包被抗原建立ELISA检测方法的报道［30］。基于重组蛋白包被建立的间接ELISA被证明是敏感、特异和准确的，但更重要的是，这些方法更容易标准化，因此适合大规模推广应用。

5 预防策略

做好养殖场所以及养鸡设备的消毒工作，适当的温度、湿度、通风处理，均能影响鸡心包积水的发病情况，但由于引发鸡HPS的主要病原FAdV-4存在，所以最行之有效的控制该病的发生仍然是疫苗的预防。目前，已报道的用于预防FAdV-4的疫苗主要分为灭活苗、弱毒苗以及基因亚单位疫苗三类。

5.1 灭活疫苗 Afzal等［31］利用感染 HPS 病鸡的肝脏组织制备灭活疫苗，田间试验结果表明，接种疫苗组死亡率为0.52%，而未接种疫苗的禽类死亡率为5.34%。另外，在疾病爆发时紧急接种灭活疫苗结果显示，未接种疫苗组死亡率达到了10.27%，接种疫苗组后死亡率仅为2.33%。韦悠等［32］利用FAdV-4和FAdV-8制备了禽腺病毒的双价油乳剂灭活苗，免疫保护期可达6个月以上。

Kim M S等［33］通过对不同 FAdV-4毒株相关免疫原性等方面进行鉴定，筛选了适合制备全病毒灭活疫苗的优势毒株，并研制了FAdV-4油乳剂灭活苗。通过免疫攻毒试验证实，FAdV-4油乳剂灭活苗能够产生对血清4型，8a型以及11型的多血清型交叉保护。Pan Q等［34］针对在中国爆发的FAdV-4型毒株，分离制备了灭活疫苗，疫苗免疫后能够产生高水平的抗体，其中，Th2（白细胞介素-4）免疫应答优于Th1（γ干扰素）。

5.2 弱毒疫苗 Mansoor M K等［35］利用鸡胚连续传代12次后致弱一株FAdV-4毒株，并与商品化的组织灭活苗共同免疫14日龄无母源抗体的肉鸡，24日龄时应用10倍剂量ELD50进行攻毒实验，结果表明，弱毒疫苗比商品化灭活苗保护率更高，肝脏、心脏等组织器官伤害性更小，也证明了该弱毒疫苗具备免疫原性，有制备商品化弱毒苗的潜质。

2004年，一株没有HPS临床症状的FAdV-4毒株被分离出来，命名为FAdV-4 ON1，SPF鸡经口服和肌肉内感染接种FADV-4 ON1后，都能产生强烈的抗FADV-4特异性抗体反应。同时，禽类抗感染细胞因子如干扰素（IFN）和白细胞介素（IL）-10在肝脏中的表达量也明显增加［36］。

目前，灭活疫苗的接种是防治HPS较为有效的方式，具备制备简单、免疫效果确实的优点，但是同时也存在刺激机体产生抗体时间短，需重复免疫的缺点。弱毒疫苗维持免疫时间长，但可能存在弱毒毒力返强，遗传不稳定的缺点。为了解决这个问题，研究人员试图开发一种亚单位疫苗，即利用大肠杆菌原核表达系统表达FAdV-4的Penton蛋白，肉鸡的免疫原性及攻毒保护试验证实原核表达的Penton蛋白能够提供90%的保护力［37］。

6 结 语

FAdV-4对肉鸡有很高的致病性，目前已经扩散至亚洲、中美洲、南美洲以及一些欧洲国家，鉴于其扩散迅速，FAdV-4对肉鸡养殖业造成的巨大损失，受影响的各个国家和地区应制定预防方案，避免更严重的损失。

增强鸡对FAdV-4的感染抵抗力是控制HPS发生的关键。一方面，环境因素起着至关重要的作用，控制好饲养环境温度、湿度以及通风情况能够有效地控制心包积液症状的发生，另外做好鸡舍环境的整体消毒工作，能够减少FAdV-4在环境中的数量，抑制疾病的爆发。另一方面，疫苗接种仍是控制该病爆发的最有效方式，目前，研究人员正致力于灭活疫苗、弱毒疫苗以及亚单位疫苗的研究，并取得了一定的研究进展，更有研究人员指出，可以尝试利用减弱沙门氏菌菌株为载体制备口服疫苗，口服疫苗对于鸡群免疫具备独特的优势，鸡群免疫通常费时费力，如果口服疫苗能够研制成功，相信一定具备广阔的应用市场。

除了针对FAdV-4的应用研究外，对于FAdV-4的基础研究也不应忽视，ORF19基因缺失导致致病性增高还有待进一步研究证实。新分离FAdV-4中国株ORF29出现了33nt和6nt的基因缺失，是否为适应中国宿主与环境的表现也需要继续探索。