超高效液相色谱-静电轨道阱质谱正负切换同时筛查定量谷物饲料中的51种农药残留

吴剑平，张 婧，周悦榕，严 凤，潘 娟

（上海市兽药饲料检测所，上海201103）

随着现代畜牧业养殖技术的不断进步发展，饲料的质量安全越来越受广大养殖户的重视。2018年欧洲发生的鸡蛋中发现氟虫腈农药残留事件再次将饲料中的农药残留问题推到了风口浪尖。我国目前已发布的针对农药残留进行监管的主要法规公告，其中于2013年3月正式实施的《中国食品安全国家标准：食品中农药最大残留限量》（GB 2763-2016），规定了322种农药在10大类食品中的2293项农药最大残留限量，成为我国农药残留食品安全市场监管的唯一强制性国家标准。虽然其对于谷物、油料作物、蔬菜、水果等食品中的农药残留监管十分有力，而对作为畜牧业重要投入品的饲料中的农药残留并没有明确规定，既没有提出受监管的种类，也没有提出相应的限量标准。目前国内对水果、蔬菜和谷物中多种农药残留检测方法研究较多［1-3］，而关于饲料中多种农药残留的检测方法却相对较少［4-5］。当今检测食品中多种农药残留的方法手段日趋多样化，主要有高效液相色谱法（HPLC），气相色谱法（GC）和色谱质谱联用法、生物传感器法和酶联免疫法这五大类。气相色谱结合FPD或ECD检测器同时检测多种农药残留具有灵敏度高和特异性好的特点［6-7］，但是，对于一些热不稳定和高沸点化合物就难以检测。液相色谱-串联质谱法可以较好的弥补这一缺点，同时也具有高灵敏度和高特异性的优点［8-9］，有报道采用液相色谱-串联四级杆质谱法检测蔬菜水果中65种农药残留［10］，其检测灵敏度可达到 20 μg／kg。 静电轨道阱质谱（Orbitrap Mass）作为高分辨率质谱，相比串联四级杆质谱具有更高的质量精确度，同时也具有较高的灵敏度和较宽的线性范围，在多残留分析中可以兼顾较多质量数接近的化合物的定性准确性和浓度差别较大的化合物的定量精密性［11-13］。

1 材料与方法

1.1 仪器 Ultimate 3000双三元超高效液相色谱、Excalibur控制软件、Trace Founder数据处理软件，Mass Frontier化合物结构推断软件，四极杆串联静电轨道阱质谱带HESI电离喷雾源（Q Exactive）、高速冷冻离心机（Allegra X-22R，BECKMAN COULTER）；AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；水浴控温氮吹仪（N-EVAP，上海安谱公司）。

1.2 材料、药品与试剂 2，3，5-混杀威（2，3，5-Trimethacarb），3，4，5-混杀威 （3，4，5-Trimethacarb），涕灭威（Aldicarb），涕灭威亚砜（Aldicarbsulfoxide），灭害威（Aminocarb），恶虫威（Bendiocarb），丁酮威（Butocarboxim），丁酮威亚砜（Butocarboxim sulfoxide），丁酮砜威（Butoxycarboxim），甲萘威（Carbaryl），克百威（Carbofuran），3-羟基克百威（Carbofuran-3-hydroxy），乙硫苯威（Ethiofencarb），仲丁威（Fenobucarb），呋霜灵（Furathiocarb），异丙威（Isoprocarb），灭梭威（Methiocarb），灭多威（Methomyl），速灭威（Metolcarb，MTMC），灭杀威（Xylylcarb，MPMC），杀线威（Oxamyl），抗蚜威（Pirimicarb），猛杀威（Promecarb），残杀威（Propoxur），特草灵（Terbucarb），硫双威（Thiodicarb），久效威（Thiofanox），灭除威（XMC），乙霉威（Diethofencarb），苯硫威（Fenothiocarb），涕灭威砜（Aldicarb Sulfone）， 2，4，5-三氯苯氧乙酸（2，4，5-Trichlorophenoxy-Acetic acid， 2，4，5-T），2，4-二氯苯氧乙酸（（2，4-Dichlorophenoxy-Acetic acid， 2，4-D），2-萘氧乙酸（2-Naphthyloxyacetic Acid），4-氯苯氧基乙酸（4-Chlorophenoxyacetic acid），三氟羧草醚（Acifluorfen），苯草醚（Aclonifen），溴苯腈（Bromoxynil），调果酸（Cloprop），二氯吡啶酸（Clopyralid），环丙酸酰胺（Cyclanilide），2，4-滴丙酸（2，4-Dichlorprop racemate），氯氟吡氧乙酸（Fluroxypyr），氟磺胺草醚（Fomesafen），赤霉酸（Gibberellic acid），碘苯腈（Ioxynil），2-甲基-4-氯苯氧乙酸（2-Methyl-4-Chlorophenoxy Acetic Acid，MCPA），2-甲基-4-氯苯氧丁酸（2-Methyl-4-Chlorophenoxy-g-Butyric Acid，MCPB），2-甲基-4-氯苯氧丙酸（Mecoprop），鱼藤酮（Rotenone），绿草定（Triclopyr）（50 μg／mL，Bepure®，北京振翔科技有限公司）；乙腈、甲酸（色谱纯，Merk，德国）；去离子水（自制，电阻率≥18 MΩ·cm）；高纯氮、高纯氩（纯度均为99.999%，上海佳杰特种气体公司）。

1.3 色谱条件 色谱柱：Syncronis C18 150 mm×2.1 mm 3 μm，柱温：30 ℃，流速：0.3 mL／min，进样量：10 μL，流动相：A 为 0.1%甲酸，B 为 0.1%甲酸乙腈，采用梯度洗脱程序如表1，所得典型特征离子质量色谱（XIC）图如图1所示。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Procedure of gradient elution

图1 样品添加定量限浓度典型XIC图Fig 1 Typical XIC of sample with LOQ concentration

1.4 质谱条件 使用Thermo Fisher公司的Q Exactive四极杆静电轨道阱质谱带HESI电离喷雾源质谱检测器对1 μg／mL的51种农药标准溶液进行建库优化，兼顾各目标化合物优化后的质谱条件为：选择正负离子切换模式，正电压3200 V，负电压2600 V，鞘气（Sheath gas）压力344 kPa，辅助气（Aux gas）流速 5 L／min，吹扫气（Sweep gas）流速 0.3 L／min，碰撞气压力 0.2 Pa，毛细管（Capillary tube） 温度325℃，辅助气加热（Aux gas heater temperature）温度350℃，离子透镜射频电压（S-lens RF voltage）50.0 V；扫描模式为全扫描加目标物二级离子碎片扫描模式，一级母离子扫描范围为100～800 M／Z，母离子扫描分辨率为70000，静电轨道阱离子捕获器门限值（AGC Target）为3×106，最大注入捕获器时间（Maximum inject time）为 100 ms，二级碎片离子扫描分辨率为17500，二级碎片离子捕获器门限值（dd-MS2 AGC Target）为 1×105，最大注入捕获器时间（dd-MS2 Maximum inject time）为 50 ms，同时最大响应离子（Top N）选取5个，动态排除时间（Dynamic exclusion time）5 s，数据处理软件提取离子质量精度5 ppm，精确至小数点后5位（表2）。

1.5 前处理条件 准确称取谷物饲料样品4.00 g，加入 5.00 mL 0.1 mol／L 盐酸溶液振荡湿润2 min，再加入15 mL甲醇，振荡2 min后室温下超声15 min，然后8000 r／min转速下离心5 min，取上层清液0.5 mL，加入 0.1% 甲酸 0.5 mL 混匀后 14000 r／min离心3 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤后上机测定。

表2 51种农残化合物母离子和子离子Tab 2 Parent ion and Daughter ion of 51 Pesticides

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2 结果与分析

2.1 线性定量范围的确定 将51种农药残留先用甲醇配制成50 μg／mL的混合标准贮备液，再将空白谷物饲料按1.5项样品前处理方法获得空白样品基质溶液，用此溶液将标准贮备液分别稀释成1、2、5、10、20、50、100、500 ng／mL 标准曲线工作溶液，按1.3项与1.4项的仪器方法上机检测，将检测结果进行线性回归，获得各目标化合物的标准曲线，结果见表3。实验结果表明，在1～500 ng／mL区间内 37 种化合物的 R2＞0.99（R＞0.995），14 种化合物的 R2＞0.98（R＞0.99），线性良好。

2.2 检测限与定量限的确定 选择20个空白样品，按优化条件进行处理后上机测定，取与标准品图谱中相同保留时间的噪音信号平均值，以信噪比S／N≥3 为检出限（LOD），S／N≥10 为定量下限（LOQ），确定该方法对的检出限与定量限，国外有相关规定对不在其肯定列表目录中的农残化合物一律要求不得高于 10 μg／kg 的限量［14］，因此，本方法在结合信噪比和实际检测需要的情况下选择10 μg／kg作为方法检测限，20 μg／kg 作为方法定量限，其检测限处各化合物信噪比见表2，实际样品检测限处XIC图谱见图1。实验结果表明，检测限附近峰型良好，定性准确。

2.3 基质效应的考察 为验证方法基质效应，选取不同种类空白谷物饲料6批，按1.5项前处理方法进行操作，将其空白溶液中分别加入1倍定量限的51种农药残留，其回收率结果在50%～120%之间，RSD＜10%，证明该前处理方法处理后的样品溶液还是有一定的基质效应影响，但是，考虑到农药残留物质种类繁多，性质差异较大，作为一个多残留物质同时筛查和定量的方法，很难在兼顾到每一种目标物的同时完全消除基质效应的影响，因此，采用基质标准溶液定量，这可以在很大程度上减少基质效应影响，将其控制在可接受的范围内。

2.4 方法准确度与精密度实验 为验证方法精密度与准确度，采用标准添加法使用6批不同谷物饲料，每批称取等量6份，6份一组分三组，分别加入1倍定量限、2倍定量限、5倍定量限的51种农残化合物，所得结果如表4所示。实验结果表明，该方法检测谷物饲料中51种农残化合物时回收率结果在50.61%～109.49%之间，RSD＜10%，证明该方法具有较高的准确度与精密度。

2.5 方法选择性的验证 选择20个空白样品，按优化条件进行处理后上机测定，未发现有假阳性结果，表明该方法的选择性良好。

表3 51种农药残留标准曲线Tab 3 Standard curve of 51 Pesticides

表4 51种农残化合物准确度和精密度Tab 4 Accuracy and precision of 51 Pesticides in Grain feed

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3 讨论与结论

3.1 前处理方法的研究 尝试了多种前处理方法，包括固相萃取柱法、分散固相萃取法和直接萃取后稀释进样法，发现无论是固相萃取柱法还是分散固相萃取法都会产生对某些化合物的歧视效应，因为多残留检测面对的目标化合物的范围广泛，性质差异也较大，最后还是选择直接萃取后稀释法作为本方法前处理方法。尝试了0.1 mol／L盐酸溶液 ∶甲醇＝1 ∶3，1 ∶1，3 ∶1以及 0.1 mol／L 盐酸溶液 ∶乙腈＝1∶3，1∶1，3∶1的提取1倍定量限、2倍定量限、5倍定量限的51种农残化合物的效率，主要考察对象为回收率均值和标准偏差，并将其中回收率结果在均值的±40%以外的数据定义为乖离数据，统计其个数，实验结果见表5。通过这三项指标，发现使用0.1 mol／L盐酸溶液 ∶甲醇＝1 ∶3和1∶1以及0.1 mol／L盐酸溶液 ∶乙腈＝1∶3的回收率均值均达到了70%以上，结合对各化合物回收率的相对标准偏差比较可知，使用0.1 mol／L盐酸溶液与甲醇组成的提取剂均具有更小的相对标准偏差，而统计乖离数据个数也佐证了0.1 mol／L盐酸溶液 ∶甲醇＝1∶3具有更小的歧视效应，因此，选择该条件作为前处理方法。

表5 谷物饲料中51种农残化合物提取效率研究Tab 5 Research on Extraction Efficiency of 30 Carbarmates in grain feed

3.2 定性与定量方法的研究 根据欧盟相关规定［15］，以识别分（identification points，IPs）为基础进行化合物的定性分析，对于不同法规要求的残留物，确证所需的IPs也各不相同，A类（违禁）需满足4IPs，B类（限用）满足3IPs，农药残留适用违禁物质A类，因此，需要4IPs来进行确证；不同的技术所获得的IPs也不同，静电轨道阱质谱作为高分辨质谱获得的一个母离子有2.0IPs，相对应的一个子离子有2.5IPs，因此，选出一对合适的母离子与子离子就可以确证一个农残化合物。按照此原则和1.3～1.4项的仪器方法，对目标农药残留药物进行了标品的进样并建库分析，获得最合适的目标物母离子精确质量数、保留时间以及其二级碎片离子的全扫描图谱，结合Mass Frontier所推断的子离子找出丰度最高的子离子和母离子一起作为确证所需的定性离子。51种农药残留的保留时间、母离子精确质量数和子离子精确质量数相结合可作为定性依据，具体信息见表2。定量时用一级母离子的精确质量数对总离子流图进行提取色谱图，对目标物的色谱峰进行积分，通过曲线校准或单点校准进行定量分析。

3.3 区分同分异构体的研究 方法中涉及的目标化合物包含多对同分异构体，比如丁酮威亚砜和涕灭威亚砜，丁酮威砜和涕灭威砜，丁酮威和涕灭威，灭除威和灭杀威等，它们具有相同的分子组成，因此，即使静电轨道阱质谱拥有高达140000分辨率的质量精度也无法区分这些化合物，但是，多残留筛查过程中不可排除这些化合物同时存在的可能，因此，经过实验验证可采用三种不同方法解决这一问题。其一，通过质谱前端的液相部分对元素组成相同但分子结构差异较大的化合物采用优化梯度洗脱条件，增加色谱分离度的办法，使同分异构体目标化合物的保留时间有较大差异，从而实现分离定性，例如本方法中丁酮威亚砜和涕灭威亚砜等；其二，通过质谱源区对同分异构体目标化合物母离子带电离行为的差异，分别检测其不同的加合物形式进行区分，例如丁酮威和涕灭威，丁酮威砜和涕灭威砜这两对化合物经过单标进样后发现涕灭威和丁酮威砜在ESI+离子源作用下难以获得+H的母离子，而主要以+Na离子形式存在，而丁酮威和涕灭威砜母离子则主要以+H形式存在，因此，在保留时间接近难以区分时，检测不同形式的母离子加合物也可以起到区分同分异构体的目的；其三，有些同分异构体化合物保留时间非常接近，母离子加合物形式也相同，那只能通过单标进样后分析其所产生的特征碎片离子的差异进行区分，灭除威和灭杀威就是一例。

本研究建立了超高效液相色谱-静电轨道阱质谱法检测谷物饲料中的51种农药残留物的检测方法和目标化合物的质谱数据库。谷物饲料样品经0.1 mol／mL HCl∶甲醇＝1 ∶3 提取，高速离心，经稀释后进样分析。实验结果表明，51种，农残化合物分离良好，在定量范围内均线性良好（线性相关系数r≥0.99），回收率也可达到 50.61% ～109.49% ，相对标准偏差（RSD）小于9.3%。本方法具有简便、快速、灵敏、准确等特点，适用于谷物饲料中同时筛查和定量农残化合物。