实体瘤CART治疗面临的挑战*

丁 烁 赵 磊 Rojina Shilpakar 魏云巍

(哈尔滨医科大学附属第一医院肿瘤腔镜外科，哈尔滨 150001)

近年来，嵌合抗原受体(CAR)修饰T 细胞在治疗肿瘤中取得了很大进展。CART细胞(Chimeric antigen receptor T cell,CART)将能识别肿瘤相关抗原(Tumor associate antigen，TAA)的单链抗体和能促进T 细胞活化的信号传递结构域融合表达于自体T 细胞的表面，从而赋予该T 细胞以肿瘤靶向的杀伤活性和持久扩增的能力，抗体与相应的肿瘤抗原结合后能使T 细胞活化，进而发挥抗肿瘤效应。不同于生理性的TCR，重组CARs 与抗原的结合不需要依赖于MHC的递呈，有效避免了肿瘤细胞MHC 表达下调这一免疫逃逸机制;同时，CARs 不仅能够与蛋白质结合，还能识别糖类、神经节苷脂、蛋白多糖、高度糖基化的蛋白，更加广谱杀伤肿瘤细胞。CART 在血液肿瘤治疗中获得了突破，但由于受实体瘤中微环境复杂、免疫逃逸机制多样、肿瘤抗原靶点繁杂、且实体瘤体积大、CART细胞难以归巢到肿瘤组织等多方面因素的影响，CART 在实体瘤的治疗实践中仍有部分障碍。本文针对CART实体瘤治疗存在的问题及目前研究的现状综述如下。

1 肿瘤微环境

实体肿瘤的微环境对其增殖、转移、免疫逃逸等生物学行为具有重要的推动作用。实体肿瘤与血液肿瘤不同，其微环境中存在大量的纤维基质和免疫抑制细胞，同时通过物理屏障和免疫屏障保护肿瘤组织、抵抗免疫细胞的攻击[1]。因此，针对实体肿瘤微环境的CART治疗方式有望起到一定的效果。

1.1物理屏障 恶性肿瘤微环境中的物理屏障由其周围基质组成，其中包括大量的纤维结缔组织等[2]。这些基质成分不仅通过物理方式阻止免疫细胞进入肿瘤微环境与肿瘤细胞接触，而且通过与微环境的其他物质和肿瘤细胞的相互作用影响肿瘤细胞的增殖、转移等[3]。如在胰腺癌肿瘤微环境中透明质酸(Hyaluronan)含量明显增多，并且其与胰腺癌的病理类型和生物学行为密切相关[4-6]。肿瘤细胞的物理屏障同样阻止了CART细胞的浸润，针对这种情况Moon等[7]和Wang等[8]都分别研发了靶向成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activation protein,FAP)的CART细胞，使肿瘤周围纤维结缔组织形成减少，从而增加淋巴细胞的浸润。

1.2免疫屏障 有些实体肿瘤组织中TIL的数量并不少，但对肿瘤杀伤作用仍不明显，其中TME的免疫屏障起到重要作用[9]。免疫屏障主要是对TIL起免疫抑制作用，其中调节性T细胞、骨髓抑制细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞本身及其分泌的因子均参与了对T细胞的免疫抑制作用。CART细胞与肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)相似，在肿瘤微环境中同样接受复杂的信号网络调节。①免疫检查点(Checkpoint)：免疫检查点其实是肿瘤细胞和免疫细胞调节的抑制信号。当T细胞与肿瘤细胞接触时，肿瘤细胞上的免疫检查点受体通过与T细胞上的配体相结合，抑制T细胞发挥抗肿瘤作用。目前发现的免疫检查点很多，如程序性细胞死亡蛋白/受体1(Programmed cell death protein 1,PD-1/PDL-1)、细胞毒性T细胞抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3蛋白(Lymphocyte activation gene 3 protein,LAG3)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3,TIM3)等[10]。其中CTLA4和PD-1/PDL-1是目前研究最多也最具有代表性的靶点。CTLA-4位于细胞膜，当其上调时可抑制CD28和B7的共刺激激活信号并使T细胞的细胞周期停滞、阻止其增殖[11-14]。PD-1则通过与PDL-1结合抑制T细胞激酶信号的激活，阻止T细胞活化[15]。针对免疫检查点抑制，CART治疗目前采用两种改进策略：一种为CART与免疫检查点抑制剂如Nivolumab和Pembrolizumab等联合用药[16]；另一种为制备靶向免疫检查点的CART细胞[17]。两种方式均取得了良好的效果，但仍有待大量研究加以证实。②免疫抑制细胞：实体肿瘤微环境中包含了大量免疫抑制细胞，如调节性T细胞(Regulatory T-cells,Tregs)、肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAMs)、骨髓源性细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)等。这些免疫抑制细胞及其分泌的抑制性因子如IL-10、IL-4等通过调控复杂的信号网络抑制CART细胞激活或增加微环境纤维基质含量，阻止其与肿瘤细胞接触以及对肿瘤细胞的杀伤[18]。③肿瘤细胞本身因素：实体瘤占恶性肿瘤的绝大多数且种类繁多，各种恶性肿瘤组织来源不同、内部结构不一、各部分细胞分化程度各异，加之患者间的个体差异，使得CART靶向治疗可能仅对肿瘤的部分细胞有效，有时甚至会增加肿瘤复发和转移的风险[19,20]。

2 CART细胞靶点的选择

肿瘤表面的抗原可分为相关性抗原(TAA)和特异性抗原(TSA)两类。在实体瘤治疗研究的早期，CART细胞多针对实体肿瘤的TAA而非TSA，容易产生“脱靶效应”，导致正常组织的损伤[21]。为使CART细胞更具安全性，研究中多从以下三个方面对CART细胞加以改进：①在CART细胞中加入“自杀基因”，如HSV-tk、Caspase9等。这些“自杀基因”可根据需要(如患者CRS反应剧烈时)中止CART细胞的杀伤效应，表达HSV-tk的CART细胞可以在更昔洛韦的刺激下发生凋亡[22]；表达Caspase9的CART细胞也同样可以在小分子药物A1903的作用下发生凋亡[23]。但实际中“自杀基因”并不是对所有CART细胞均有效，且有些转染的“自杀基因”如HSV-tk会自身激活造成CART细胞的无辜消耗并影响其杀伤效果[22]。近年来，CD20和EGFR也被尝试用于CART细胞的“自杀基因”[24,25]，可分别经利妥昔单抗和西妥昔单抗刺激后导致细胞死亡，但其功效仍有待进一步确认。②选择肿瘤特异性更强的靶点。理论上选择特异性肿瘤靶点是解决“脱靶效应”的最好方式。然而，CART细胞只能识别肿瘤细胞表面的抗原靶点，因此寻找仅在肿瘤细胞膜上特异性表达的靶点并非易事。表皮生长因子变异受体(Epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ)和多态性上皮黏蛋白1(Mucin 1,MUC1)是实体瘤CART治疗中研究最多的特异性抗原。人源化的EGFRvⅢ抗体主要用于脑胶质瘤的治疗，前期研究显示靶向EGFRvⅢ的CART细胞和NK细胞均对脑胶质瘤细胞杀伤作用明显同时不损伤正常组织[26,27]。MUC1是一种高糖基化、高分子量的膜蛋白，靶向MUC1的CART细胞也被认为是一种可行的抗肿瘤方式[28]。Posey等[29]近期研究也表明，靶向Tn-MUC1的CART细胞可在体内外杀伤白血病和胰腺癌细胞。然而，TSA的临床试验未见大宗病例报道，其有效性和安全性仍待临床试验评估。③制备非永久表达CART细胞。通常情况下编码CAR的基因通过病毒转染至T细胞DNA中，使其能够永久性表达。但考虑到目前可用的实体瘤靶点多为TAA，CART细胞永久表达可能对拥有相同TAA的正常组织造成损伤。间皮素是肿瘤细胞的TAA，其在正常组织中也有少量表达[30]。Beatty等[31]将表达间皮素CAR的mRNA序列转染至患者T细胞中，在治疗中他们发现，这种CART细胞仅在人体内存在1～2个月，在此期间胰腺癌患者腹腔转移灶明显好转而且未对其他脏器造成损害。④增加CAR对肿瘤细胞的识别能力。肿瘤细胞本身具备多种抗原可供识别，但传统CART细胞一般只能识别一种抗原，一旦其所识别的抗原为TAA就可能产生“脱靶效应”。Roybal等[32]设计了一种识别双抗原的CART细胞，首先CART细胞识别肿瘤细胞A抗原并激活细胞内CAR编码序列表达，CAR表达后其表面的单链抗体再识别肿瘤细胞的B抗原，从而激活CART细胞并杀伤肿瘤细胞。这些靶向双抗原的CART细胞可以杀伤表达双抗原的肿瘤细胞，使杀伤更为精准，同时避免了“脱靶效应”的发生[33]。Cao等[34]还设计了一种双结构的转换器，转换器一端连接CART细胞表面的单链抗体、另一端连接肿瘤细胞表面的抗原。通过使不同转换器与不同抗原结合，达到利用单一CART细胞治疗多种肿瘤和识别肿瘤细胞多个靶点的目的，从而使CART治疗更为精准、可控。

3 T细胞代谢变化

实体肿瘤周围往往伴随血管畸形和纤维结缔组织增生，形成低氧、酸性、缺乏必需氨基酸(精氨酸、色氨酸等)的微环境。在这种环境下，浸润T细胞存活困难、激活障碍，较难达到理想的肿瘤杀伤效果[7]。精氨酸和色氨酸是T细胞激活所需要的重要物质，精氨酸酶和吲哚胺2,3二氧化酶(Indoleamine 2,3 Dioxygenase,IDO)可分别分解精氨酸和色氨酸，从而调节T细胞的激活状态。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞和骨髓细胞均会分泌上述两种酶，通过减少精氨酸和色氨酸的含量，阻碍T细胞的增殖和持续激活[35,36]。Mussai等[37]研究表明，神经母细胞瘤可通过过表达精氨酸酶Ⅱ抑制靶向GD2的CART细胞在微环境内的增殖。Ninomiya等[38]也证实，抑制IDO活性后，CART细胞增殖和杀伤能力均增强、分泌细胞因子增加。然而，此类研究仍较少，可能会成为今后实体瘤治疗研究的方向之一。

综上所述，实体肿瘤中存在物理屏障、免疫屏障等诸多因素影响CART细胞的治疗效果。虽然CART细胞实体瘤的临床前实验取得了进展，但无论是寻找不同肿瘤的适宜靶点、突破肿瘤微环境的抑制作用，还是增强CART细胞本身的杀伤效率和持续时间，都需要进一步的临床前实验和临床实验去突破和证实。

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