预防猪流行性腹泻返饲技术的研究进展

廖少山，汤德元，曾智勇，王 彬，黄 涛，胡玲玲，龙冬梅，叶 丽，杨 伟，石元菊，郭倩妤，刘巧玲（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

PEDV是单股正链RNA冠状病毒，核酸具有感染性，基因组长27000～33000个核苷酸，已测定的PEDV的CV777毒株完整基因组大小为28 033bp[1]。PEDV对外界环境耐受力很差，喜欢低温、高湿环境，可在低温和高湿环境中长期存活，但是干燥粪便中的PEDV在37℃条件下4 d内死亡[2]。一般的消毒剂对其均有效果，氯仿和乙醚效果最佳。该病最近几年在全世界迅速流行，中国、东南亚国家、日本、韩国、美国、墨西哥、加拿大流行特别严重，对养猪业造成的损失特别严重，且有趋势愈发严重。是继“猪高致病性蓝耳病”后，对我国的养猪业又一迎头重击，在我国许多猪场，防控PED是重中之重的工作。对该病目前还没有可行的治疗之法，有时发病治疗后病情会稍有好转，但极易反复，复发后病势更不可控[3]，可能是加快PEDV的变异而危及整个猪场，甚至导致出现地方性流行。虽有商品性PED灭活疫苗或弱毒疫苗，但由于疫苗质量、流行毒株变异、免疫程序影响、产生抗体速度慢等诸多因素导致PED防控效果并不理想。目前，PED暴发后，猪场普遍采取母猪返饲进行应急处理，2013年北美暴发PED疫情后，美国专家力荐返饲，取得了显著效果[4]。现在我国不少猪场在出现PED疫情后也采用相同的防控措施，效果明显。但是，纵观我国养猪行业，大多数的技术人员对于返饲技术不掌握，当PED暴发时，大多数猪场不敢进行返饲或不能科学地进行返饲防控，只是采取抗菌消炎等方法进行保守性综合治疗，徒劳无功，效果甚微。返饲其实一种古老的、传统的人工自然免疫方法，返饲就是将含有活病原菌的病料给猪定期喂食，促使猪体受到轻微感染刺激而又不表现出致病，在感染刺激下猪体内慢慢地产生抗体而起到免疫该病的作用[5]，对母猪返饲是让妊娠母猪产生免疫（类似于接种口服弱毒苗），从而使新生仔猪通过哺乳获得母源抗体，能抵抗病毒感染的过程[6]。简义虎等[7]设计试验，研究返饲母猪血清中IgG、IgA抗体水平和对母猪体外排毒情况进行检测，结果表明：母猪在返饲后第11 d猪血清中IgG抗体明显上升，并在第20 d IgA与IgG检测值均达至最高，返饲后第2 d开始向外排毒，在第15 d唾液与粪便均未检测到PEDV。证明在母猪产前15～30 d返饲效果最好，病毒感染仔猪的概率最低，为临床防控该病提供理论依据。罗鹏等[8]设计试验，用PED灭活疫苗和弱毒疫苗对待产母猪进行免疫，与同类母猪进行返饲形成对照，检测两组母猪产生抗体的速度和水平，试验结果表明：采取母猪返饲比接种灭活疫苗免疫产生抗体更快，效果更好，而疫苗免疫虽然能起到一些作用，但是抗体产生速度太慢，小猪得不到及时保护，很难及时控制住PED对猪场造成的损失。齐海涛等[9]试验表明：返饲能有效地控制冠状病毒、轮状病毒的感染，只要使用科学返饲技术进行返饲管理，从实践来看，科学对母猪返饲是可以有效地控制PED的。

1 人工母猪返饲简述

在PED的暴发时，束手无策的猪场通常会使用妊娠母猪返饲来防控该病，减少经济损失。返饲其实是一种古老的传统的人工主动免疫方法，返饲就是当突发某种疫病而又无可行的治疗方法情况下，将含有活病原菌的病料给猪定期喂食或适量肌肉注射，促使猪体受到轻微感染刺激而又不表现致病，感染刺激下猪体内慢慢地产生抗体而起到免疫该病的作用，母猪返饲是用上述方法，先让妊娠母猪产前产生免疫（类似于接种口服弱毒苗），从而使新生仔猪通过哺乳获得母源抗体，可抵抗病毒感染而起到自我保护的过程。

其人工母猪返饲原理可简单表述如下：（提取活病原体）肠道感染病毒－（病毒感染）病毒在肠道复制－黏膜识别免疫刺激－淋巴迁移、乳腺淋巴细胞和免疫刺激－乳汁中抗体增加－对哺乳仔猪产生保护力[10]。

2 返饲样品的制备

选择7日龄之内发病第2 d的活仔猪(最好出现腹泻之前有呕吐症状的仔猪)进行扑杀，因为发病初期哺乳活仔猪肠道中PEDV含量远远高于母猪和死亡仔猪肠道中的PEDV含量，2～5日龄仔猪，在开始出现症状至18 h内，其肠道收集到的病毒含量和其毒力是最高的，（在临床观察和实验室检测中发现）因为初生仔猪小肠的绒毛比较长，其上边具有更多数量的成熟的小肠上皮细胞，这些上皮细胞非常有利于PEDV的繁殖。然后放血，并对体表进行清洁、消毒，剖开腹部，暴露出腹部肠管，在十二指肠与空肠的交界处和空肠与回盲交界处用缝线双结扎，用手术剪剪下双结扎点之间的小肠，连同小肠内容物一并收集，含毒量相对较高的其他内脏也可适量收集，存放于病料袋中，置低温无菌暗光下单独保存并记录仔猪的耳号。保存的同时，取少量病料迅速进行PEDV鉴定，经检测为PEDV为阳性，并排除可能含有其他烈性病原体，如猪蓝耳病、猪伪狂犬病和猪瘟等病毒。确定病料安全有效后，把所有返饲病料剪成碎块，放入5 ℃等量牛奶中或PBS液中，用组织匀浆机制成匀浆，经100目筛过滤。在匀浆中加入适量抗生素如庆大霉素3 mL、新霉素1 g、硫酸黏菌素2 g/100 g组织，对匀浆稀释 (如8 mL鲜牛奶或PBS液/g组织)。有条件时，可配合荧光定量PCR[11]测定返饲病料中病毒的拷贝数，返饲病料及时置低温（4 ℃）、阴暗条件下保存，如不当天使用而需要保存于-40℃的冰柜中备用。

3 人工返饲步骤

3.1 在母猪妊娠阶段合理营养

日粮中可以适量加入适量的低分子脂肪酸，可提高初乳中蛋白质、免疫球蛋白和不饱和脂肪酸等营养、免疫物质含量，从而增强仔猪抵御病原体特别是肠道病原体的能力，减少哺乳仔猪的肠道疾病[12]。返饲前1周开始在饲料中添加抗生素、多维和葡萄糖，饮水中清除细菌和球虫，增加返饲母猪的体质。对怀孕后期的母猪饲料中添加肠肽2000 g+绿益态1000 g/t。连续饲喂7～10 d，可促进母猪的泌乳功能[13]。

3.2 每头返饲用量10 mL上述制备液

但具体用量可以根据实际情况，调至效果最佳剂量，病料拌入饲料或饮水中一次性投喂，整个猪场最好全场同1 d投喂完。返饲后母猪出现轻微腹泻症状，则效果最好，母猪一般2～3 d后会自然恢复，若猪群以前发生过腹泻并做过返饲，出现症状的猪数量在10%左右，若近期免疫过相关疫苗，出现上述症状的返饲猪数达到50%以上，如果种猪群没有免疫过相应疫苗，则以80%以上猪出现症状视为返饲成功，否则要进行再次返饲。

3.3 效果检测

有条件的猪场可以在返饲前后采取血清和粪便做ELISA（酶联免疫吸附试验）进行检测[14]，用ELISA方法既可以检测抗原也可以检测抗体水平来判断返饲的效果。

4 人工返饲的应用现状

2013年北美暴发PED疫情后，开始也是束手无策，损失惨重，无奈之下美国专家们力荐返饲，采取母猪返饲措施后损失减少，取得了显著效果。2014年Matthew B等[15]在美国进行调查分析表明，当PEDV在全阴性猪场暴发PED后愿意立即开始或继续对母猪PEDV返饲驯化的占84%，对主动返饲的688家猪场进行返饲效果统计，结果显示有604家猪场返饲效果明显，占88%，84家猪场返饲效果不明显，占12%。国内返饲成功的案例也多有报导，2013年陈桂华等[16]对邵阳某规模化猪场实施返饲防控，返饲后2～5 d母猪出现呕吐和轻微腹泻症状，第5 d后病情逐渐好转，未见到母猪流产等其他不适反应，经返饲后母猪共产下259窝仔猪，仔猪未出现呕吐、水样腹泻等症状，则表明该猪场PED得到有效控制，表明通过返饲母猪及配合其他相应的饲养管理措施预防PED具有较好的效果。2014陈志林等[17]在某大型猪场发生PED期间实施返饲母猪，通过结果分析表明采取返饲母猪措施后效果显著，大大地降低初生仔猪在PED暴发时的腹泻率和死亡率。齐海涛等试验表明返饲也能有效地控制冠状病毒、轮状病毒的感染。2017年四川某规模化养猪场发生腹泻疫情，开始病情难以控制，后来采取以返饲母猪为主要措施的综合防控方案，方案执行1个月后疫情得到有效控制，发病率由原来的90%以上降低到10%以下[18]。

5 母猪返饲的利弊

5.1 返饲的优点

病料是自家猪场的病猪，取材方便、低廉，如不采集病料，对于猪场内病、死猪也要及时进行无害化处理，也是“废物利用”，同时也是清除病源控制疫病扩散的好办法，一举三得。其方法可操作性强，简单易学，容易上手，会操作人群广泛，一般的专业技术人员皆可操作，需要设备与器材简单，一般只需要可调高速组织捣碎机（家用绞肉机也可）、冰箱、电子秤（精确到0．1 g）、手术刀、剪刀、凉的生理盐水、新鲜牛奶或PBS液、一次性手套、搅拌棒、样品袋、消毒桶、消毒剂、工作服、胶鞋等，大部分都是猪场常备的，所需要的药品只有适量的抗生素。当发病毒株的毒力强、病毒滴度高，免疫原性好，产生抗体速度快，母猪返饲效果好。母猪可在返饲2周后产生抗体，而且抗体在母猪体内的消退速度慢[19]，返饲后机体产生抗体的速度要快于疫苗免疫，猪在返饲后第11 d猪血清中IgG抗体明显上升，并在第20 d IgA与IgG检测值均达至最高，这样就可对即将（两周后）产仔的母猪进行返饲，对仔猪起到免疫保护作用；但是疫苗免疫产生抗体速度没有这么快，很难实现及时免疫。返饲病料是取自家猪场病猪，病原体是来自于自己猪场所发之病，刺激母猪产生的抗体就是抗该病原体抗体，对本猪场病原体针对强，特异性好，能在较短时间内终止疫病流行降低损失[20]，就算该猪场此次发病病原体是变异毒株，此法也能起到免疫效果，但是疫苗免疫就不可能做到，疫苗免疫面对毒株变异时不但没有效果，反而会适得其反，导致病情加重。

5.2 返饲的缺点

如果返饲的病料是变异强毒株，没有经灭活或驯化等生物安全性处理，很可能使强毒株蔓延到整个猪场，而且还有可能导致强毒株地方流行，存在暴发疫病或散毒的风险；同时返饲病料中可能带有其他病原体，如猪蓝耳病毒、伪狂犬病毒等强毒，这样的返饲反而成了散毒；返饲只针对PED，对其他病原体引起的腹泻并没有效果。而且母猪返饲仅适用于哺乳仔猪发生PED之际，没有发生此疫情时不得提前进行返饲预防；对2周内待产的妊娠母猪和哺乳期母猪也不能进行返饲，因为无法做到确保初乳中含有母源性抗体，及时使仔猪产生免疫力，而且还有排毒的隐患。返饲病料若病毒剂量不够或病毒滴度不高，不能够使母猪产生足够的病毒抗体，易造成返饲无效或导致机体复发感染。返饲病料中含有大量的其他抗原，如异己蛋白抗原，会使其母猪机体受到强制免疫应激，母猪抵抗能力下降而感染其他疾病，同时，过度的免疫刺激，还有可能导致怀孕母猪流产、产弱胎与死胎，后备母猪不发情。初发PED的仔猪中所取得的病料，利用刚出生还未吃初乳的仔猪感染发病进行病毒扩增成本高、速度慢，现在的猪场规模化程度越来越高，母猪数量巨大，难以满足整个猪场母猪需要的返饲病料量，常因没有足够的病料很难实现全场同时免疫。此法只能作为应急措施，也未能先知先用、防范于未然，只能在减少猪场损失上发挥作用，不可能做到零损失。如果返饲的母猪，可能已经感染其他病原体，经过返饲，很可能导致母猪复合感染，或者原有的感染加重或加速呈现病症。

5.3 返饲过程及注意事项

病料加工处理过程中使用过的器皿和废弃病料，要及时进行消毒或销毁处理。病料的加工、返饲、无害化处理都应由专人负责，每次进出加工区域要经过严格消毒，其他无关人员不得进入病料加工区域；返饲后12 d内专业技术人员不得换岗或替换。配怀舍母猪不能进产房，但产房断奶母猪随时可以进配怀舍；返饲后2 d内配怀舍不作消毒，发病猪前2 d可不作治疗，这种方法可能会导致少量母猪流产，尤其是配种后1月的母猪，所以切勿盲目加大返饲剂量。在2周内待产母猪和哺乳期母猪不得进行返饲；对每头母猪尽量做到返饲一次性成功，不宜反复长时间返饲。母猪返饲是在猪场发生PEDV野毒感染时预防新生仔猪发生腹泻的常用应急措施，而不能适用于紧急免疫；要做到仔猪吃上初乳，有的仔猪吃不到母乳或哺乳不足时，必须采取人工喂养。返饲后注意消毒处理，母猪的腹泻粪便必须进行无害化处理，可用生石灰进行掩盖并及时运出圈舍统一处理，对整个猪场大环境也要进行消毒，防止猪圈内传播，可用挑战的金盾消毒剂，按照1： 300与水混合后，使用消毒车对猪舍进行大规模的喷洒消毒，每天早晚各喷洒消毒一次，并及时采取圈舍隔离措施，防止病毒扩散。PEDV对光照和温度都不稳定，病毒脱离动物后会很快死亡，其抗原性发生改变而削弱了返饲效果，加工好的病料若不能立即使用，必须置低温（4 ℃）、阴暗条件下保存[21]。在返饲后，对于出现腹泻的母猪，要利用抗生素预防细菌感染以及添加电解质多维及时补水和防止酸中毒[22]；若有采食量下降的现象，需要添加鱼肝油、维生素及电解质等营养物质对腹泻康复的母猪进行增膘，防止返饲母猪偏瘦[23]；若返饲后的部分待配母猪出现发情推迟，可在饲料中添加葡萄糖等营养物质，促其发情，对发情状态难以恢复的母猪可做推期配种。

综上所述，当前PED在我国并没有消灭，各地呈偶尔散发态势，随时可能卷土重来，PED仍是猪场面临的巨大挑战。很多养猪人会发现，即使已精心做好流行性腹泻疫苗的免疫接种，猪场依然会有PED发生，且疫苗的价格不菲，有时花了钱也没有得到期望的结果。因此如何做好猪场PED的防控需要更多的养殖人员及科研工作者以科学的态度对待PED的防控，当PED来临时，要根据临床症状、实验室诊断，然后通过母猪返饲，利用自家毒株去引诱猪体产生抗体，仔猪通过哺乳获得母源性抗体来提升仔猪抗病能力，起到控制疫情的效果。但是返饲又是一把锋利的双刃剑，当猪场发生腹泻时要冷静、科学分析，确定引起仔猪腹泻的病原为PEDV，并排除不含有其他烈性病原体感染后再进行返饲，严格按照科学的方法进行返饲，认真操作，及时监控疫情，病情无法控制时要以大局为重，可以选择性扑杀，尸体无害化处理来控制疫情扩散[24]。尽管返饲技术存有缺陷，而且应用上有一定的限制，但在目前尚无有效控制PED措施的现实情况下，不能否认其积极的作用。PED疫病发生后，对于束手无策的猪场，考虑通过母猪返饲的措施来进行防控，无疑是首选的方案，应当及时采取人工母猪返饲；专业技术人员认真按照科学的返饲技术步骤对母猪进行人工返饲，仔细排查返饲注意事项，返饲技术的缺点是可以克服的。在今后的研究、工作中还需多加总结、科学分析，力求完善返饲技术，稳定返饲效果。