先天性外中耳畸形(2)——致病基因的研究现状

张天宇 陈颖

先天性外中耳畸形又称小耳畸形，是耳鼻喉科常见的先天性疾患之一，表现为耳郭大小、形态、位置和结构的先天异常，多合并外耳道狭窄、闭锁以及锤砧关节融合、镫骨缺失、听骨链固定、中耳腔发育不良等中耳畸形。其发病率为0.83/万～17.4/万不等，全球发病率约为2.06/万，其中我国的发病率为1.4/万[1]。先天性外中耳畸形患者可表现为单一的临床症状，也可以是综合征的耳部表现。

先天性外中耳畸形发病机制尚不完全明确，本课题组流行病学研究发现孕期流感样综合征、自然流产史、阴道炎、宫颈炎等炎症感染和油漆、杀虫剂等有毒化学物质暴露等因素是该病的危险因素[2]，而遗传因素在该疾病的发生中也有重要作用。流行病学调查提示4%～8%的先天性外中耳畸形患者有家族史[2, 3]；先天性外中耳畸形在同卵双胞胎中的发病率(38.5%)远大于异卵双胞胎(4.5%)[4]。由于外中耳胚胎来源于第一、二腮弓的内、中、外胚层及神经嵴细胞[5]，与腮弓发育、神经嵴细胞分化发育及外中耳形态发生过程中相关的基因，如：同源盒基因家族成员(HOXA1、HOXA2等)、SIX2、EYA、TBX1、TCOF1等基因的突变可导致不同的外中耳畸形综合征[6]。本文将介绍先天性外中耳畸形致病基因的识别及功能研究现状。

1 染色体异常所致先天性外中耳畸形

染色体片段的增加、缺失或易位可导致先天性外中耳畸形的发生[7]，即便是既往认识的良性突变，也可致病；Balikova等报告了一个常染色显性遗传小耳畸形综合征家系，该家系患者还合并鼻泪管闭锁、虹膜缺损症状[8]，4p16上增加的5个串联拷贝是致病遗传变异，增加的串联拷贝既往报道为人群良性拷贝数变异区。

染色体异常所致先天性外中耳畸形的机制目前尚不完全明确，Feenstra等[9]对18 q缺失综合征的研究解释了染色体缺失所致外中耳畸形的可能机制之一。18 q缺失综合征指的是由于18号染色体长臂片段缺失所致的身材矮小、智力发育异常、肌张力减退、听力损失、足部畸形等先天异常症候群。Feenstra等注意到18 q缺失综合征患者中耳腔狭窄发生率高，因而选取了4例合并双侧外耳道狭窄的18 q缺失综合征患者进行SNP-array分析，发现患者染色体中有459 kb重叠缺失片段；该片段包含推测的C180rf62蛋白编码信息和已知TSHZ1基因，其中TSHZ1基因(teashirt zinc finger homeo Box 1)是teashirt锌指蛋白家族成员，在小鼠胚胎中广泛表达，TSHZ1基因敲除小鼠模型中，该基因被证实与外中耳发育相关，小鼠TSHZ1基因功能缺失时，可以导致中耳畸形；TSHZ1基因完全失活小鼠可导致新生鼠死亡，多发发育障碍，包括严重的中耳畸形，与单纯外耳道狭窄患者表型相似。进一步扩大验证中，作者选择11例双侧耳道狭窄且耳郭正常患者进行TSHZ1基因双向Sanger测序，发现4例患者及其中1例患者的无症状家属携带该基因杂合突变；证实了TSHZ1是导致单纯外耳道狭窄的候选基因，且不完全外显[10]。对TSHZ1基因突变所致外耳道狭窄的研究提示，染色体片段缺失所致外中耳发育所需基因的半定量不足是该疾病的发生机制之一，为将来新致病基因的识别、表型-基因型研究提供了新思路。

2 单基因所致外中耳畸形

经典遗传学研究方法，如：家系连锁分析、细胞基因学等方法发现了Treacher Collins综合征、Townes-Brocks综合征等耳畸形综合征的致病基因[11, 12]；近年来由于全基因组测序、全外显子测序等高通量测序和生物信息学分析的应用，先天性外中耳畸形综合征致病基因的识别进展诸多，目前已有超过十余种耳畸形综合征，如：Nager综合征、LAMM综合征等的致病基因被发现，Miller综合征为颅面畸形合并轴后性肢体畸形的耳畸形综合征，是首个利用全外显子测序技术识别致病基因的孟德尔遗传疾病[13]。基因工程、基因编辑技术的发展使得疾病的动物模型更易获得，在小鼠、斑马鱼、猪等转基因或基因敲除动物中，可模拟出人类耳畸形疾病的表型，促进了对基因功能的认识，有助于对疾病的发生机制的研究和疾病的预防。

2.1TCOF1基因突变阴性的Treacher Collins综合征(Treacher Collins syndrome,TCS) Treacher Collin综合征患者中，约63%～93%携带TCOF1基因突变，仍有部分患者不能明确致病基因，提示了该疾病的遗传异质性[14, 15]。Dauwerse等[16]通过全基因组拷贝数分析发现一例TCOF1基因突变阴性的Treacher Collin综合征患儿携带染色体13q12.2区间的缺失，该缺失片段包含了POLR1D基因全部序列和LNX2基因的第一外显子，在810例TCOF1基因突变阴性的TCS患者中行POLR1D和LNX2测序，发现一例男性患儿携带POLR1D基因的杂合无义突变；扩大样本验证对242例无TCOF1基因突变的TCS患者进行POLR1D测序，发现20例患者携带该基因的10种杂合无义突变和7种错义突变，确定了POLR1D是TCS的致病基因；由于POLR1C与POLR1D基因功能相互联系，进一步对252例TCS患者的POLR1C基因进行筛查，发现3例家系患者携带该基因致病性突变，确定了POLR1DPOLR1C为TCS的致病基因[16]。POLR1D突变可引起常染色体显性或隐性遗传的表型，而POLR1C突变则导致常染色体隐性遗传的表型[17]。动物模型研究中发现POLR1D、POLR1C在斑马鱼胚胎发育期的颅面部组织高表达，polr1c-/-或polr1d-/-的斑马鱼突变体中核糖体生化生成减少，导致神经上皮死亡及神经嵴细胞缺陷，引起颅面软骨发育异常，第一、第二腮弓体积的减少，最终导致斑马鱼突变体颅面发育异常，该异常与TCS患者面容相吻合。该异常的细胞死亡是tp53途径依赖的，通过抑制tp53功能可减少突变斑马鱼的畸形程度，为TCS的预防和治疗提供了新的思路[18]。

2.2Meier-Gorlin综合征(Meier-Gorlin syndrome，MGS) 即耳-髌骨-矮小综合征，是一种先天性小耳畸形合并髌骨缺失或发育不良、发育迟缓的罕见综合征。约94%的MGS患者可有不同程度的小耳畸形，是该综合征最常见的表型[19]。MGS目前已知有8个致病基因，分别为ORC1、ORC4、ORC6、CDT1，CDC6、CDC45L、MCM5和GMNN基因，除GMNN引起常染色体显性遗传表型外，其余基因均导致常染色体隐性遗传疾病[20～25]。ORC1、ORC4、ORC6均为起始识别复合物(origin recognition complex，ORC)1～6亚基的编码基因，在真核细胞G1相期间，首先形成起始识别复合物并召集CDC6、CDT1等蛋白，形成复制前复合体(pre-replication complex，preRC)，从而加载微小染色体维持解旋酶蛋白2～7(minichromosome maintenance helicase，MCM helicase)至复制起始位点，进而允许DNA的复制[21]；CDC45在DNA复制过程，与MCM解旋酶转化为激活态，参与DNA解旋[23]。GMNN编码的Geminin蛋白则是通过调控CDT1发挥抑制DNA复制[24]的作用。ORC6基因点突变的果蝇在第三龄幼虫阶段死于DNA复制缺陷和异常染色体的生成，即便通过在突变体中过表达ORC6蛋白，存活的果蝇仍较正常体有缺陷。而CDC6突变的斑马鱼则会出现生长发育迟滞，生育能力减低，与MGS患者表型一致[26]。

2.3HOXA2基因所致耳畸形 HOXA2突变可引起常染色体隐性遗传的耳畸形综合征，患者症状除外耳畸形、耳道狭窄及不同程度中耳畸形外，尚可合并腭裂[7]；也有报道指出HOXA2无义突变可导致常染色体显性遗传的非综合征型外中耳畸形[27]。目前HOXA2在人群中的致病突变报道较少，而动物模型则很好的揭示了HOXA2在外中耳发育中的关键作用及突变后致畸的机制。HOXA2基因功能与外耳的形态发生密切相关，如：在小鼠胚胎E11.5前失活，可导致无耳畸形，而在E12.5～13.5日失活，则导致小耳畸形；Minoux等[28]利用谱系追踪揭示了小鼠的耳郭来源与HOXA2表达阳性的神经嵴细胞(neuralcrestcell)，提示耳郭来源于第二腮弓，而异位表达于第一腮弓的HOXA2基因可诱导形成镜像的耳郭和外耳道。其机制是HOXA2基因可通过与Bmp4、Bmp5的非编码区结合，调控BMP通路，作为转录调节对耳郭的形态发生起关键作用。

2.4下颌面骨发育不全Guion-Almeida型(Mandibulofacial dysostosis, Guion-Almeida type; MFDGA) Guion-Almeida等曾报道了颅面发育不全合并小头畸形、生长发育和言语发育迟滞的4例患儿，并提出该表型是全新的颅面发育不全综合征的亚型[29，30]。2012年Lines等[29]利用全外显子测序发现12例颅面畸形(其中11例有小耳畸形)合并小头畸形患者的致病基因EFTUD2，该患者队列中包含Guion-Almeida报道的2例患者。更多的突变报道和表型关联分析则指出EFTUD2基因导致的下颌面骨发育不全的最易外显的表型(>80%)为发育迟缓、小头畸形、颧弓发育不良、小耳畸形及听力损失，食道狭窄发生概率虽仅为27%，但是该综合征与其他颅面畸形的特征表型有区别[30]。Eftud2fn10a斑马鱼中EFTUD2的无义突变导致中枢神经及脊柱神经元祖细胞的大量凋亡，其机制是无义突变的EFTUD2基因引起转录水平上RNA剪接异常，出现大量内含子保留(intron retaining)和外显子跳读(exon-skipping)的转录本，进而导致错误的RNA降解，激发p53通路导致斑马鱼表型的异常，解释了EFTUD2基因突变导致的MFDGA患者中出现神经系统发育迟滞的原因[31]。

2.5眼耳综合征(oculo-auricular syndrome，OAS) 为HMX1基因(H6 family homeobox 1 gene) 缺陷引起的先天性眼部、耳部发育异常。患者可有先天性白内障、眼球震颤、虹膜后黏连、小眼、脉络膜视网膜缺损；耳部表型可有耳郭位置低垂、外耳道狭窄、耳垂裂、耳郭形态异常等[32～34]。HMX1基因错义、插入突变可导致鼠、牛的耳郭形态、位置异常[35, 36]。HMX1缺失突变小鼠在体实验发现Hox-Pbx-Meis 复合体通过HMX1基因的保守进化区(evolutionarily conserved region，ECR)作用，调节HMX1基因在头面外侧部的表达[37]。

3 患者人群中的致病基因筛查研究

先天性外中耳畸形患者中，仅有少部分患者有家族遗传史，更多为散发患者；而69.5%患者为单纯外中耳畸形；目前明确已知致病基因的多为综合征型的单基因遗传疾病。在大宗患者人群中的致病基因筛查，可以为散发型患者提供更多的致病基因筛查信息。

在先天性外中耳畸形人群中利用直接测序对已知基因进行突变检测的结果欠佳，致病突变检出率低，且同一突变在人群中重复性低。Monks等[38]对散发的单纯小耳畸形患者进行HOXA2和SIX2基因的突变检测，并未发现致病突变。Hao等[39]对106例先天性耳畸形患者进行GSC、HOXA2 和PRKRA基因的直接测序发现5个新发突变，其中包括GSC基因g.994C>T同义突变，该突变在10例正常对照者中被检测到，考虑为核苷酸多态性，而首次报道的HOXA2基因5’UTR区g.90G>A和g.114A>C生物学功能尚不明确[39]；Lin等[40]对181例先天性外中耳畸形患者进行PACT基因的测序，并未发现散发或家系患者携带该基因的致病突变。这些研究结果提示先天性外中耳畸形的发病机制中遗传学病因仅能解释部分患者的发病，且致病基因具有异质性。

利用高通量测序筛查耳畸形人群遗传信息的工作中，Zhang等[41]利用全基因组关联分析对939例半面短小患者和2 012例健康人群进行90万个SNP位点检测，筛选出显著相关的位点8个，可能相关位点5个，该13个位点所在基因分别是ROBO1、GATA3、GBX2、FGF3、NRP2、EDNRB、SHROOM3、SEMA7A、PLCD3、KLF12和EPAS1，与神经嵴细胞的发育和血管生成密切相关，为先天性外中耳畸形致病基因提供了丰富的遗传学资料。

4 未来研究展望

先天性外中耳畸形的遗传学致病机制研究对该疾病的预防、治疗有重要作用，可能也会使对外中耳发育、中耳疾病的发生发展得到更深入认识。但是，目前仍面临诸多问题：①外中耳畸形的发生具有不同外显率，受累程度差异大，合并畸形种类多，表型复杂；②外中耳发育的相关研究仍不够充分，对突变检测中所识别突变的功能难以解释；③耳畸形的致病基因具有异质性，其发病可能是单基因或多基因引起；在未来的工作中，利用连锁分析和各类测序手段进行耳畸形患者的遗传学信息检测过程中，仍需要对耳畸形临床表型进行细化；同时，对外中耳发育、相关基因调控、各类信号通路的研究，也将对先天性外中耳畸形致病机制的研究有重大意义。