补肾清肝中药配伍对间歇性低氧诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型p38MAPK/NF—κB信号通路的干预效应研究

邬春晓+张京春+刘玥+马林沁+乔羽+雷舒雁+郑乔仙

[摘要] 研究补肾清肝中药配伍对间歇性低氧致人脐静脉内皮细胞损伤模型p38MAPK/NF-κB信号通路的干预效应。实验采用改良的间歇性低氧诱导人脐静脉内皮细胞建立体外细胞损伤模型，以补肾清肝中药有效成分配伍（异钩藤碱、桃叶珊瑚苷及川芎嗪）作为干预药物，首先进行中药最优配伍浓度体外筛选，然后选择最优配伍浓度作为干预剂量，观察其对模型p38MAPK/NF-κB信号通路的干预效应。结果显示异钩藤碱、桃叶珊瑚苷及川芎嗪在0.01 mg·L-1时具有最佳的体外抗炎效应。间歇性低氧组NF-κB p65入核量及p-IκB较对照组与其他各组均显著增加，同时免疫荧光染色NF-κB p65可见间歇性低氧组出现明显NF-κB p65核移位表现，内皮细胞黏附程度明显增加；与间歇性低氧组相比，p38MAPK抑制剂组及补肾清肝中药配伍组 p-p38MAPK，NF-κB p65入核量及p-IκB表达量均明显较少，内皮细胞黏附明显被抑制。该研究表明，补肾清肝中药最优浓度配伍通过将抑制p38MAPK的磷酸化作为起始，继而阻断了NF-κB的核移位行为，抑制其转录功能，实现对间歇性低氧诱导血管内皮细胞损伤模型的保护效应。

[关键词] 间歇性低氧； 人脐静脉内皮细胞； 中药； p38MAPK； NF-κB

[Abstract] This study aims to explore the intervention effect of Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver on intermittent hypoxia（IH） induced injury model of HUVECs through p38MAPK/NF-κB signaling pathway in vitro. HUVECs injury model was induced by modified IH treatment. The effective components of Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver including isochteroside， aucubin and ligustrazine were used as intervention drugs. The optimal compatibility concentration of them was screened in vitro， and then the optimal compatibility concentration was selected as the intervention dose to observe the effect on p38MAPK/NF-κB signaling pathway in IH induced injury model of HUVECs. The results showed that isochnae， aucubin and ligustrazine had the best anti-inflammatory effect at concentration of 0.01 mg·L-1. NF-κB p65 and p-IκB in the nucleus in IH group were significantly higher than those in the normal control（N） group and the other groups. Immunofluorescence staining showed significant translocation of NF-κB p65 nucleus in IH group， and HUVECs adhesion capacity in IH group was increased significantly. As compared with IH group， the expression levels of p-p38MAPK， NF-κB p65 and p-IκB in p38MAPK inhibitor（INH） group and Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver（GDC） group were significantly decreased， and HUVECs adhesion capacity in INH group and GDC group was significantly inhibited as well. The optimal concentration of Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver can inhibit the phosphorylation of p38MAPK， and then inhibit the nuclear translocation and transcription function of NF-κB. This may be the mechanism of the protective effect of Chinese medicine on IH induced injury model of HUVECs.

[Key words] intermittent hypoxia； HUVECs； Chinese medicine； p38MAPK； NF-κB

《中国心血管病报告2016》指出，高血壓是心脑血管疾病的重要危险因素之一，50%～75%的脑卒中和40%～50%的心肌梗死发生均与血压升高相关。阻塞型睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）是独立于年龄、肥胖、吸烟等引起高血压的重要危险因素。OSAS患者睡眠中频繁发生的呼吸暂停，使机体处于间歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）和再氧合交替出现的特殊内环境。IH不同于持续低氧的特点是存在低氧后的正常氧的插入，较持续低氧使更易于造成血管内皮功能的损伤，是OSAS致高血压靶器官损伤的重要机制之一[1]。中医药对高血压在调节机体整体平衡、控制血压水平稳定及防治靶器官损害等方面具有独特优势。作者在前期临床实验中，深入探索高血压病的中医病机与证治规律，发现补肾清肝中药配伍治疗轻中度高血压具有保护血管内皮功能、调控血压变异性等靶器官保护效应[2]，但具体作用机制尚不明确。本研究通过间歇性低氧诱导人脐静脉内皮损伤建立体外模型，观察补肾清肝中药配伍对该模型p38MAPK/NF-κB信号通路的干预效应，以期为中药对OSAS相关心血管疾病的防治提供实验证据。endprint

1 材料与方法

1.1 药物 中药钩藤的有效成分异钩藤碱（批号111927-201403）、中药杜仲的有效成分桃叶珊瑚苷（批号111761-200601）、中药川芎的有效成分川芎嗪（批号110817-201307）均由中国食品药品检定研究院提供。

1.2 细胞来源 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）由健康产妇、正常分娩12 h内脐带的脐静脉分离提取（脐带由中日友好医院妇产科提供）。

1.3 HUVECs的分离及培养 无菌条件下取健康产妇、正常分娩12 h内脐带20～30 cm，PBS冲洗脐带并去除两端，镊子扩张静脉腔，插入三通管并固定。三通管另一端连接针头后插入倒置的PBS瓶中，抽推进器使PBS流入针筒，关闭此开关阀后推推进器使PBS流入脐带，注意防止气泡。以上操作清洗脐带2～3次直至无肉眼可见血色。脐带末端插入带有胶皮管的针头，重复清洗1次后，将连接三通管针头插入0.1%胶原酶溶液瓶中，倒置酶瓶后抽推进器使酶液流入针管，关闭此开关阀后推推进器直至酶液充满整条脐带。脐带置入37 ℃水浴15 min后回收消化液，PBS清洗后重复回收2次，收集消化液，加入预先室温放置的ECM（20%FBS）5 mL，灌洗、离心（1 000 r·min-1，5 min）收集细胞，制成细胞悬液按1×106～1.5×106个/mL接种于10 mL培养皿中，置于37 ℃，5%CO2条件下培养。细胞90%以上单层融合状态时用0.25%胰蛋白酶消化、传代培养至4～7代用于以下实验。

1.4 间歇性低氧致HUVECs损伤模型的复制 模型复制方法参考文献进行改进[3]。使用低氧装置Modular Incubator Chamber（MIC-101）（美国 Billups-rothenberg）建立间歇性低氧诱导内皮损伤细胞模型。将细胞培养皿放入低氧装置中（预先紫外照射消毒），暴露时以低氧（1%O2，4%CO2，96%N2）气流洗脱细胞培养舱中的气体，监测直至氧气浓度达到5%后停止。继而维持低氧状态5 min（即IH时段），再以正常氧（21%O2）气流洗脱低氧气体，而后再维持10 min（即再氧合时段），周而复始形成循环2，4，6，8次逐级递增至16次。

1.5 分组与干预方法 正常对照组（N）：将培养基换为无血清ECM，培养箱中常规培养4 h。间歇性低氧模型组（IH）：将培养基换为无血清ECM，置于低氧装置内，低氧/复氧循环16次（4 h）。补肾清肝中药配伍组（GDC 1，0.1，0.01，0.001）：将异钩藤碱、桃叶珊瑚苷、川芎嗪均按1，0.1，0.01，0.001 mg·L-1加入到无血清ECM中，替换原培养基，低氧/复氧循环16次（4 h）。p38MAPK抑制剂组（INH）： 将培养基换为无血清ECM，p38MAPK阻断剂SB203580 5 mg·L-1预处理30 min，此后置于低氧装置内，低氧/复氧循环16次（4 h）。

1.6 检测指标及方法 炎症因子检测：实时荧光定量PCR（QPCR）技术测定HUVECs上清液中IL-1，IL-6，ICAM-1，E-selectin及TNF-α的含量。p38MAPK/NF-κB通路相关蛋白的检测：采用Western blot的方法检测各组间p-p38MAPK表达量的变化。分离细胞胞浆、胞核蛋白后检测NF-κB通路炎症相关蛋白胞浆、胞核中表达量差异。HUVECs细胞间黏附能力检测：荧光探针标记THP-1细胞，加入处理后HUVEC 细胞37 ℃共孵育30 min，荧光显微镜下拍照比较黏附密度。

1.7 统计方法 数据采用SPSS 20.0统计软件分析处理，实验数据均采用±s表示，组间比较采用t检验，2组以上比较采用One-way ANOVA，检验显著性水平定为P<0.05。

2 结果

2.1 补肾清肝中药配伍最佳干预剂量的筛选 为探讨补肾清肝中药配伍的体外对炎症因子的干预效应，同时进行其最佳干预剂量的筛选，分别设立了异钩藤碱、桃叶珊瑚苷及川芎嗪1，0.1，0.01，0.001 mg·L-14个质量浓度梯度进行筛选。结果显示补肾清肝中药配伍在0.01 mg·L-1（GDC）这个剂量浓度时炎症因子的表达IL-1，IL-6，TNF-α明显低于其余各干预组（P<0.05），见图1。因此选定0.01 mg·L-1作为最佳干预剂量进行后续实验。

2.2 补肾清肝中药配伍最佳干预剂量对p38MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响 Western blot结果显示，IH组中NF-κB p65入核量、p-IκB较对照组与其他组均显著增加，NF-κB通路明显被激活。IκB，p-p65，IKK-β等无明显变化，见图2。同时免疫荧光染色NF-κB p65，Confocal镜下可见IH组出现明显NF-κB p65核移位表现。蓝色标记的HUVECs细胞核內出现绿色荧光标记的NF-κB p65。入核后的NF-κB p65亮度明显高于胞浆中表达的NF-κB p65，见图2。INH组、GDC组 p-p38MAPK，NF-κB p65入核量、p-IκB表达量与IH比较明显较少，说明补肾清肝中药配伍及p38MAPK阻断剂SB203580可通过抑制IH后p38MAPK的磷酸化阻断其下游NF-κB信号通路。

2.3 补肾清肝中药配伍最佳干预剂量对间歇性低氧诱导HUVECs损伤过程中 THP-1 细胞黏附的影响 荧光显微镜下观察，正常对照（N）组（128.2±6.72）可见少量 THP-1细胞黏附；IH组（231.2± 8.43）可见明显增加THP-1 细胞黏附；GDC组（134.8±8.67）可见明显抑制THP-1细胞黏附于HUVEC；INH组（122.4±7.12）可见明显抑制THP-1细胞黏附于HUVEC，见图3。

3 讨论endprint

在建立稳定的间歇性低氧诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型基础上，观察了不同浓度的补肾清肝中药配伍的干预效应，发现异钩藤碱、桃叶珊瑚苷、川芎嗪在0.01 mg·L-1这个剂量时具有最佳的抑制炎症因子的效应，并不具有剂量依赖性。

大量研究报道补肾清肝中药配伍的各有效组分（异钩藤碱、桃叶珊瑚苷、川芎嗪）具有广泛的心血管系统药理作用。桃叶珊瑚苷是中药杜仲的主要活性成分，具有明显的抗炎活性，能够抑制NF-κB的p65亚基由细胞胞浆内向核内的移位，并通过阻止IκB的磷酸化和降解，使胞浆内IκB浓度升高，进而抑制NF-κB活性从而下调TNF-α和IL-6的合成与表达[4]。对于桃叶珊瑚苷及桃叶珊瑚苷苷元抗炎活性的进一步研究表明，真正发挥作用的分子可能是桃叶珊瑚苷水解产物桃叶珊瑚苷苷元，桃叶珊瑚苷苷元通过抑制细胞中NF-κB活性进一步抑制TNF-α的生成[5-6]，与本研究结果一致。异钩藤碱是茜草科植物钩藤的主要有效成分，具有降压及抗炎作用。有学者研究发现静脉注射异钩藤碱可降低未开胸犬的平均动脉压；同时能够调控NO的产生，降低磷酸化细胞外信号调节激酶蛋白和p38MAPK，抑制炎症反应，起到保护血管、降低血压的作用[7-8]。研究表明川芎嗪可通过改善氧化應激，降低炎性因子水平，拮抗Ca离子内流，调控一氧化氮水平，抑制血管内皮炎症性损伤等实现降压作用[9-11]。为进一步探讨补肾清肝中药配伍血管内皮保护机制，从体外角度观察了中药干预后模型NF-κB通路蛋白表达量的变化，结果发现，与模型组比较，补肾清肝中药配伍最优剂量组p-p38MAPK，p-IκB的表达明显被抑制；同时采用免疫荧光标记NF-κB p65，观察到补肾清肝中药配伍干预后的NF-κB p65入核量明显减少。

综上所述，补肾清肝中药配伍将抑制p38MAPK的磷酸化作为起始，阻断NF-κB的核移位，抑制其转录功能，最终实现其对间歇性低氧诱导血管内皮细胞损伤模型的保护效应。

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[责任编辑 张宁宁]endprint