基于多波长HPLC—DAD比较栀子不同部位化学成分差异

2018-01-23肖日传罗光明董丽华朱玉野朱继孝张风波伍珊娜

中国中药杂志 2017年23期

肖日传+罗光明+董丽华+朱玉野+朱继孝+张风波+伍珊娜

[摘要] 采用多波长HPLC-DAD，同时测定栀子不同部位去乙酰车叶草酸甲酯、羟异栀子苷、栀子苷、绿原酸、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ和竹节参皂苷Ⅳa 7种化合物的含量，比较各成分在栀子不同部位的分布。结果表明栀子中各成分在各部位分布不同，且含量存在较大差异，其中栀子苷主要分布在果实和叶中，竹节参皂苷IVa主要分布于根和茎中，西红花苷类成分主要存在于果实中，绿原酸以叶和茎含量较高，羟异栀子苷在叶和根中含量较高，去乙酰车叶草酸甲酯在根和茎中含量较高。通过分析栀子不同部位化学成分含量差异，为栀子资源综合开发利用和质量评价提供依据。

[关键词] 多波长高效液相色谱；栀子；不同部位；化学成分

[Abstract] Seven compounds（deacetylasperulasidic acid methyl ester， gardenoside， chlorogenic acid， geniposide， crocin-Ⅰ， crocin-Ⅱ， chikusetsu saponin Ⅳa）were determined simultaneously by multiple wavelength HPLC with diode array detector（DAD） in different parts of Gardenia jasminoides. The results showed that these components in different parts of G. jasminoides had a different distribution， and there was a large difference in content of each component. Geniposide was mainly distributed in fruits and leaves； chikusetsu saponin Ⅳa was mainly distributed in roots and stems； crocus glycosides existed mainly in fruits； chlorogenic acid had a higher distribution in leaves and stems； gardenoside had a higher distribution in leaves and roots， while ceacetylasperulasidic acid methyl ester had a higher distribution in roots and stems. Based on the analysis of the chemical composition and content difference in different parts of G. jasminoides， the basis for the comprehensive utilization and quality evaluation of resources of G. jasminoides was provided.

[Key words] multiple wavelength HPLC； Gardenia jasminoides； different parts； chemical composition

梔子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。主产于江西、湖南、湖北等地，性苦寒，有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒之功效[1]，外用消肿止痛，栀子的主要活性成分为环烯醚萜类、有机酸类、西红花苷类等[2]，现代药理研究表明栀子果实具有护肝、利胆、抗炎、抗菌、解热、镇痛和降血脂等作用。国内外对栀子药材的研究主要集中在传统用药部位果实上，而其他部位的研究则鲜有报道，据《湖南省中药材标准》[3]和《浙江省中药饮片炮制规范》[4]记载，栀子除果实可入药外，其根部也可入药，在少数民间应用广泛，主要含有齐墩果酸醋酸酯、齐墩果酸和竹节参皂苷Ⅳa等化学成分[5-6]，可用于治疗黄疸型肝炎；郑丽花等[7]对狭叶栀子的茎部位进行了化学成分的分离研究，从中鉴定出11种化合物，而王雪芬等[8]同时从栀子的根和茎中分离得到了相同的3种成分；对于栀子叶的研究，李运等[9]从该部位分离鉴定出8种化合物，表明栀子的其他部位均有一定的利用价值。

目前，有关栀子药材含量测定的报道很多，2015年版《中国药典》仅以栀子苷作为唯一检测的指标性成分，相关文献在此基础上亦测定去乙酰车叶草酸甲酯、羟异栀子苷、京尼平龙胆二糖苷等环烯醚萜类成分[1]，绿原酸成分和西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ等西红花苷类成分[2]，以便更全面地评价和反映栀子药材的内在品质；而栀子其他部位的含量测定研究则报道较少，李红等[10]以栀子根中齐墩果酸醋酸酯水解后的齐墩果酸为测定指标探索栀子根的最佳采收时间和生长期，相关学者则认为由于栀子根中含有部分游离型齐墩果酸，故水解后的齐墩果酸不能准确完全地反映药材质量，而竹节参皂苷Ⅳa在镇痛、抗炎、抗肿瘤等方面表现出一定的生理活性，作为质控标准更为合理[11]；此外，栀子茎、叶部位的含量测定仍属空白。因此综合栀子果实的主要化学成分和其他部位的含量测定研究，本实验采用多波长高效液相色谱法，首次建立同时测定栀子果实、根、茎、叶各部位中去乙酰车叶草酸甲酯、羟异栀子苷、栀子苷、绿原酸、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ 和竹节参皂苷Ⅳa 7种化学成分的含量测定方法，系统地比较栀子不同部位化学成分含量差异，分析不同部位各类成分的分布特征，为栀子不同部位的质量评控和栀子药材资源的综合开发利用提供理论支持。

1 材料

Waters e2695高效液相色谱仪，四元泵及自动进样系统，2998PDA检测器，美国Waters公司；DFY-400摇摆式中药粉碎机，浙江温岭市林大机械有限公司；KQ3200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；色谱甲醇，美国ACS公司；色谱乙腈，美国ACS公司；Milli-Q超纯水（18.2 Ω），江西中医药大学中药资源与民族药中心；其余试剂为分析纯。endprint

去乙酰车叶草酸甲酯（批号111786-201603）、栀子苷（批号110749-201614）、绿原酸（批号110753-201514）、西红花苷Ⅰ（批号111588-201602）、西红花苷Ⅱ（批号111589-201604）对照品均购自中国食品药品检定研究院；羟异栀子苷（批号PJM0324RB16）购自上海源叶生物科技有限公司；竹节参皂苷Ⅳa（批号MUST-17030201）购自成都曼斯特生物科技有限公司。栀子药材于2016年10月采自江西九江湖口县顺昌中药材种植基地，原植物经江西中医药大学中药资源学科组葛菲教授鉴定为茜草科植物栀子G. jasminoides。取样时采挖整株植物，洗净泥土，将其分为果实、根、茎、叶4部分，自然干燥，分别粉碎过4目筛，置干燥器中备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Durashell C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0～18 min，5%～15% A；18～25 min，15%～23% A；25～40 min，23%～35% A；40～50 min，35%～60% A；50～60 min，60%～95% A。体积流量为1 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长203，238，330，440 nm；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密吸取各对照品适量，加70%甲醇溶解分别制成含去乙酰车叶草酸甲酯0.015 6 g·L-1、羟异栀子苷0.295 0 g·L-1、栀子苷1.564 0 g·L-1、绿原酸0.139 2 g·L-1、西红花苷 Ⅰ 0.831 0 g·L-1、西红花苷Ⅱ 0.122 0 g·L-1、竹节参皂苷Ⅳa 0.371 0 g·L-1的混合对照品储备液，于4 ℃冰箱保存备用，临用前经0.22 μm微孔滤膜滤过即得。

2.3 供试品溶液的制备

取栀子果实、根、茎、叶粉末各0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声提取45 min，放冷后称重，用70%甲醇补足失重，摇匀滤过，取续滤液，用0.22 μm微孔滤膜滤过即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察精密吸取2.2项对照品储备液1，2，4，6，8，10 μL，分别注入液相色谱仪中，按2.1项色谱条件测定。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归分析，回归方程见表1。

2.4.2 精密度试验精密吸取2.2项混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，计算7种成分峰面积的RSD，考察仪器精密度，结果去乙酰车叶草酸甲酯、羟异栀子苷、栀子苷、绿原酸、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ 和竹节参皂苷Ⅳa的RSD分別为0.22%，0.37%，0.10%，0.074%，0.16%，0.24%，0.092%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验按2.3项方法平行制备6份供试品溶液，各取10 μL进样，测定7种成分含量，计算峰面积的RSD，考察方法重复性，结果去乙酰车叶草酸甲酯、羟异栀子苷、栀子苷、绿原酸、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ 和竹节参皂苷Ⅳa的RSD分别为1.8%，2.2%，0.64%，0.71%，0.68%，0.87%，1.0%，表明方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验精密吸取供试品溶液10 μL，分别于0，2，4，8，16，24 h进样分析，记录7种成分峰面积，计算峰面积的RSD，考察供试品溶液稳定性，结果去乙酰车叶草酸甲酯、羟异栀子苷、栀子苷、绿原酸、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ 和竹节参皂苷Ⅳa的RSD分别为0.72%，0.88%，1.2%，1.3%，0.65%，0.83%，1.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验取已知含量的药材粉末6份，每份约0.25 g，分别精密加入对照品溶液适量，按2.3项方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，分别计算各成分加样回收率及其RSD。结果去乙酰车叶草酸甲酯、羟异栀子苷、栀子苷、绿原酸、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ 和竹节参皂苷Ⅳa的加样回收率分别为101.3%，96.80%，97.54%，99.06%，103.6%，101.7%，98.96%，RSD分别为2.6%，2.8%，2.1%，1.9%，1.8%，2.3%，2.0%，表明该方法的准确度良好。

2.5 不同部位各类成分含量比较

取栀子果实、根、茎、叶各部位的干燥粉末，按供试品制备方法进样操作，以外标法计算同一批次栀子药材不同部位中去乙酰车叶草酸甲酯、羟异栀子苷、栀子苷、绿原酸、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ 和竹节参皂苷Ⅳa的色谱图见图1～4。含量结果见表2。

3 讨论与分析

3.1 栀子不同部位化学成分比较

实验药材采自江西九江湖口县栀子GAP种植基地，均为随机取样，具有代表性。从本实验结果可以看出，栀子不同部位各成分种类和含量差异较大，西红花苷类成分只在果实中存在，根、茎、叶中均不含；果实和叶中未检测到竹节参皂苷Ⅳa，而根和茎中含有竹节参皂苷Ⅳa且根部的含量大于茎；根和茎中未检测到栀子苷，而果实和叶中含有栀子苷且果实中含量大于叶；有机酸类成分在各部位均有分布，含量由高到低依次为叶、茎、根、果实；去乙酰车叶草酸甲酯在根和茎中的含量较高，叶次之，果实中最低；羟异栀子苷在叶和根中的含量较高，茎次之，果实中较低；测定结果表明，栀子不同部位各成分含量差异较大。栀子苷作为果实的指标性成分，在果实中的含量明显高于其他部位。2015年版《中国药典》记载栀子果实为传统的入药部位，而根部也作药用，为畲族常用药材，畲医称其为“山里黄根”，在浙江、福建、湖南等地的民间主要用于治疗黄疸型肝炎、肝炎后肝纤维化、风火牙痛等病症[12-13]，其临床应用由来已久，1964年，厦门市中医院康良石等[14]名老中医采用水边黄栀子根治愈传染性肝炎病例30例，1975年，广西中医学院伍绍岐[15]以板蓝根和栀子根汤合用治愈急性黄疸性肝炎病例53例，效果良好，此外，临床上已有松栀丸、复方栀子根颗粒、栀子根汤等以栀子根为君药配伍使用的中药复方。竹节参皂苷Ⅳa作为栀子根中主要的化学成分之一，表现出一定的抗炎、镇痛、抗肿瘤作用，陈伟东等[16]endprint

人以金黄色葡萄球菌为试验菌株，研究栀子根的抗菌生物活性与竹节参皂苷Ⅳa含量的相关性，结果表明起抗菌作用的可能不仅仅为该成分，是否为多组分协同作用，仍有待进一步的深入探讨。

3.2 色谱条件的选择

本实验基于栀子果实的传统含量测定方法梯度洗脱条件并对其进行了改进，栀子果实在35%乙腈梯度之前所有化学成分均已出峰，而通过前期摸索，发现栀子根、茎、叶在35%乙腈梯度以后仍有少量成分，故加长时间，让各成分达到有效分离。考察了不同浓度的磷酸溶液，发现0.2%磷酸水溶液能获得较好的峰形。对于检测波长的选择，由于栀子果实中含有环烯醚萜类、有机酸类、西红花苷类等多类成分，栀子根中含有竹节参皂苷Ⅳa等三萜皂苷类成分，单一波长难以全面反映栀子化学成分组成的全貌，故本实验采用DAD检测器对栀子样品进行全波长扫描（190～800 nm），对各波长下的色谱图进行分析比较，结果发现环烯醚萜类、有机酸类、西红花苷类的最大吸收波长分别为238，330，440 nm，而三萜皂苷类成分竹节参皂苷Ⅳa为末端吸收，最大吸收波长为203 nm，所以本实验采用203，238，330，440 nm多个波长最大可能地获取色谱组分信息，以分析比较栀子各部位化学成分的差异。

3.3 提取条件的优化

对影响提取效果的样品提取溶剂、溶剂浓度、提取时间和提取方法4个因素进行了考察。采用了50%甲醇、70%甲醇、纯甲醇和50%乙醇、70%乙醇、纯乙醇提取样品，通过观察色谱图峰形、比较总峰面积，发现以70%甲醇提取色谱峰较多且吸收大，确定70%甲醇为提取溶剂。采用了回流提取和超声提取两种提取方法进行考察，结果表明超声提取法较简便，效率高，回流提取较繁琐。综合考虑，选择超声提取作为样品的提取方法。提取时间采用了30，45，60，75 min，结果表明45 min为最佳提取时间，能最有效地提取各成分。

本实验首次采用多波长高效液相色谱法对栀子不同部位各成分进行了含量测定研究，基于中药材“一体多用”原则，为栀子非传统药用部位或新药用部位的开发利用提供实验依据，为栀子各部位质量控制评价奠定物质基础，对栀子新药新产品的创制研發具有一定的现实意义。

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