基于不同栽培阶段金线莲的代谢组学分析

李瑞姿+林军+汪厦霞+俞晓敏+陈灿理+关跃峰

[摘要] 金线莲是传统的中药及保健品，其人工栽培分为组织培养和土壤栽培2个阶段，但后者对于金线莲保健功能成分的积累是否必要尚缺乏定论。该研究以组培至壮苗及组培壮苗后再经3个月土壤栽培的金线莲为试验材料，利用GC-TOF-MS和UPLC-Q-TOF-MS对其代谢成分进行非靶向分析，找出了2个栽培阶段的差异代谢成分。结果表明，初级代谢产物中的醇类及有机酸等，在组培苗中含量较高。而寡糖、核苷类、酯类及次级代谢产物中黄酮类、萜类化合物含量在栽培苗中有明显提高。黄酮类和多糖被认为是金线莲的主要活性成分，因此土壤栽培对其有益成分的积累十分必要，经土壤栽培金线莲药用价值更高。

[关键词] 金线莲； 代谢组； 组培； 栽培； GC-TOF-MS； UPLC-Q-TOF-MS

[Abstract] Anoectochilus roxburghii is a traditional Chinese medicine and natural health products. In the modern cultivation system， A. roxburghii is micropropagated in tissue culture， and the plants are transferred to soil cultivation for months. However， it remains unclear about the necessity of soil cultivation for the accumulation of health beneficial compounds. In this paper， we performed nontargeted metabolomic analysis using GC-TOF-MS and UPLC-Q-TOF-MS， on A. roxburghii plants at tissue culture stage or after 3 months of soil cultivation. The results showed that the primary metabolites such as alcohols and organic acids are abundant in the tissue culture plants. In contrast， polysaccharide， nucleoside， esters and secondary metabolites such as flavonoids， terpenoids were significantly accumulated in cultivated seedlings. Flavonoids and polysaccharides are considered as the principle effective components in A. roxburghii. Soil cultivation period is therefore essential for the accumulation of these metabolites.

[Key words] Anoectochilus roxburghii； metabolomics； tissue culture； soil cultivation； GC-TOF-MS； UPLC-Q-TOF-MS

金線莲Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl为兰科开唇兰属多年生草本植物。该植物主要分布中国南部地区，系闽台民间特色中药，多用于肾炎、支气管炎、膀胱炎、风湿性关节炎、小儿急惊风、毒蛇咬伤等症[1-2]。药理活性分析表明，金线莲具有抗肿瘤，降血糖，保肝，抗HBV，降血压等活性[3-7]，药用价值和保健功能显著，市场价值极高。同时其株型小巧，叶型优美，叶脉金黄色，呈网状排列，是观赏价值极高的室内观叶珍品[8]。迄今为止，已从金线莲中分离出了多种化学成分，主要有多糖、氨基酸、生物碱、皂苷、甾体、有机酸、黄酮等成分，且8种必需氨基酸的含量很高，有很好的提高机体免疫力的作用，多糖和黄酮类物质被推测为其主要活性成分[9-13]。

随着人们生活水平的提高，金线莲的市场需求不断扩大。传统金线莲产品需经组培至壮苗后土壤栽培3～5个月上市。但组培壮苗与3～5月土壤栽培苗在形态上并无明显差异，因此对于继续土壤栽培的必要性存有争议，但目前还未有合适的体系来对不同栽培阶段的金线莲品质进行评估。土壤栽培是否有助于金线莲中有效成分的积累仍未清楚，其不同栽培阶段的代谢组分差异更是无人研究。本试验首次在金线莲研究中采用代谢组学的方法对不同栽培阶段金线莲的代谢组分进行非靶向分析，以期发现它们之间代谢成分的差异，揭示其品质最佳的栽培阶段，为合理开发利用提供了理论依据。

1 材料

气相色谱质谱仪器安捷伦（Agilent）7890B气相色谱，GERSTEL MPS自动进样架，LECO Pegasus HT飞行时间质谱（Time-of-Flight Mass Spectrometer）；毛细管色谱柱RESTEK Rxi-5 Sil MS（0.25 μm × 0.25 mm ×30 m）。液相色谱质谱仪器Waters UPLC-Q-TOF I-class液相色谱，Waters SYNAPT G2-Si HDMS质谱；色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）。恒温数控超声波清洗器（昆山，型号KQ-300GDV）；分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司 d=0.1mg）；纯水系统（Manufacturer milipore，型号Elix Essential 5，Milli-Q Advantage A10）；冷冻干燥机（LABCONCO，型号7754070）；CentriVap离心浓缩仪（LABCONCO，型号7812038）。endprint

甲醇（质谱纯，购于Sigma Aldrich），氯仿（色谱纯，购于泰京），甲酸（质谱纯，购于Sigma Aldrich），乙腈（质谱纯，购于Sigma Aldrich）；核糖醇（购于Sigma Aldrich）；甲氧胺（购于Sigma Aldrich）；吡啶（购于Sigma Aldrich）；BSTFA+1%TMCS（购于SUPELCO）；耗材均为代谢成分检测专用。

金线莲A. roxburghii由福州新奥生物技术有限公司提供。样品类型为：即将出瓶的组培期金线莲苗（TC），出瓶后经土壤栽培3个月的栽培期金线莲苗（SC）。

2 方法

2.1 培养信息

培养基的配制和分装：1/2MS为基本培养基，加入6-BA 2 mg·L-1，NAA 1.0 mg·L-1，芸苔素0.05 mg·L-1，香蕉100 g·L-1，琼脂粉6.5 g·L-1，糖25 g·L-1，pH 5.6～5.8，均匀分装于干净的培养瓶并加盖，120 ℃，105 kPa 20 min灭菌，及时取出冷却备用。

2.2 外植体处理和接种

10%的次氯酸钠消毒15 min后的茎段在无菌条件下切成长约1 cm含1个茎节的若干段，接种于上述培养基上。移入培养间，光照强度1 500～2 000 lx，培养4个月左右。

2.3 移栽

选高6～8 cm具3片叶以上，茎基直径约2 mm，根2～3条的瓶苗（即TC），先移出培养间放自然光照培养4～6 d后，洗凈附着在植株上的培养基，晾干后移栽至1份菜园土+2份粗沙+1份木屑的基质中自然状态下栽培3个月（即SC）。

2.4 气相色谱参数

进样量1 μL，进样口温度230 ℃，不分流进样模式，载气为氦气，气体纯度99.999 5%以上，流速2 mL·min-1。柱温箱初始温度80 ℃，保持2 min，以15 ℃·min-1升至330 ℃，保持6 min。传输线温度275 ℃。

质谱参数为离子源温度250 ℃，质量扫描范围是m/z 45～500，采集速率每秒10个扫描，溶剂延迟240 s，检测器电压为1 460 V，灯丝偏置电流为70 eV。数据处理采用LECO-Chroma TOF 软件（Software Version 4.5x，Part Number 200-999-014）。

2.5 液相色谱参数

进样量1 μL，检测波长190～700 nm；流动相为0.1%甲酸水溶液（A），0.1%甲酸乙腈溶液（B）。梯度洗脱，0～5 min，100%～95%（A）；5～7.5 min，95%～85%（A）；7.5～30 min，85%～15%（A）；30～36 min，15%～0%（A）；36～52 min，0%（A）；52～53 min，0%～100%（A）；53～56 min，100%（A）；流速0.3 mL·min-1；柱温40 ℃。

质谱参数为电喷雾电离源（ESI），正负离子扫描模式；MSE数据采集模式，碰撞能量范围10～50 eV；质谱扫描质核比范围m/z 50～1 200；质量数校正物质亮氨酸脑啡肽；毛细管电压2.0 kV；离子源温度为120 ℃；脱溶剂气温450 ℃；脱溶剂气体流速800 L·h-1；进样锥锥孔气体流速50 L·h-1；锥孔电压40 V；锥孔补偿电压80 V；雾化气压力6.5 bar；扫描时间0.2 s。

液相色谱质谱谱图解卷积及代谢物定性软件为Progenesis QI 软件（Software Version 2.2），参数设置使用软件默认值。Umetrics EZinfo 3.0 for waters，MassLynx v4.1。

2.6 样品的制备

2.6.1 气相色谱质谱检测样品的制备 干净新鲜的金线莲全株，液氮研磨。研磨好的样品于冻干机上冷冻干燥48 h至完全干燥。称取20 mg冻干样品于2.0 mL离心管中，加入1.4 mL预冷的甲醇，摇匀。加入10 μL内标物核糖醇（1 g·L-1），混匀。70 ℃，950 r·min-1，震荡10 min。11 000×g离心10 min。吸800 μL上清于5 mL离心管中，加入750 μL预冷的氯仿，摇匀。加入1.4 mL预冷的双蒸水，涡旋摇匀。2 200 g离心15 min。吸取500 μL上清到2 mL样品瓶中，真空浓缩至完全干。同时制备QC，根据样品数计算所需QC个数，确保每5个上机检测样品检测1个QC，精确吸取适量每个待上机检测样品的上清到2 mL样品瓶中充分混匀，真空浓缩至完全干。向浓缩好的样品中加入80 μL甲氧胺吡啶溶液（15 g·L-1，现配现用），37 ℃摇床，200 r·min-1，衍生化2 h。再加入80 μL BSTFA+1%TMCS，混匀，37 ℃摇床，200 r·min-1，衍生化30 min。吸取衍生化好的样品150 μL到装有内衬管的样品瓶中，每个分析样本做5个生物学重复，上机检测。

2.6.2 液相色谱质谱检测样品的制备 称取30 mg冻干样品于2.0 mL离心管中，加入70%甲醇水溶液，涡旋混匀。25 ℃超声萃取20 min。12 000×g离心10 min。取15 μL上清至新的1.5 mL离心管中并用70%的甲醇水溶液稀释10倍，混匀。取上述制备好的样品150 μL于装有内衬管的2.0 mL样品瓶中，每个分析样本做5个生物学重复，上机检测。

3 结果与讨论

3.1 不同阶段金线莲差异初级代谢产物的鉴定

GC-MS数据用LECO-Chroma 多元统计分析，共从极性的水相和非极性的氯仿相中检测到329个色谱峰。色谱峰通过与NIST和Fiehn数据库比对，以相似度大于700推断性定性，并结合已有标样，共鉴定出160个化合物，主要为糖类、氨基酸、有机酸、醇类等。SIMCA-P+（Version 11.0）分析得到供试样品在2种栽培阶段下代谢物的PCA结果分值图，在第一主成分PC1（76.16%）和第二主成分PC2（19.42%）的分值图上，2种栽培阶段的样品呈现明显分离（图1）。说明金线莲在不同栽培阶段代谢成分上存在很大差异。endprint

差异代谢物寻找需要满足以下3个标准：OPLS-DA模型中VIP>1，SPSS（IBM SPSS Statistics 22）非参数检验的P<0.05，QC RSD>40%，供试样品中差异代谢物有22个，鉴定出12个可作为快速区分2个栽培阶段金线莲初级代谢标识物（表1，2）。差异代谢物中TC高于SC的主要为有机酸和醇类，如丙酮酸差异倍数为22.6，苹果酸为6.1。SC中含量较高的主要为糖及其衍生物，其中麦芽糖差异倍数为9.93，蔗糖为3.1。

3.2 不同階段金线莲苗差异次级代谢产物的鉴定

金线莲中的药效成分目前被认为是黄酮、多糖等物质，本研究用UPLC-Q-TOF-MS分析检测样品次级代谢物。UPLC-Q-TOF-MS原始数据经Progenesis QI峰提取，峰对齐，归一化处理，ESI-共提取出4 051个色谱峰，ESI+共提取出5 460个色谱峰。在ESI 2种模式下，PCA分析（Umetrics EZinfo 3.0 for waters）显示，TC和GC呈现明显分离（图2）。

色谱峰通过与HMDB和ChemSpider数据库比对，以碎片匹配度（实际与理论）得分越接近100，质量数偏差越接近0，同位素丰度相似度越接近100，结合MassLynx v4.1软件及文献查阅推断定性，ESI-检测到1 211个信号，ESI+检测到3 134个信号，主要为黄酮糖苷类、酯类、萜类、有机酸、生物碱、甾醇等。差异代谢物寻找通过4个标准：PCA模型中VIP>1，QI非参数检验的P<0.05，CV>30，差异倍数在两倍以上。最终找到差异代谢物83种，其中SC含量较高的物质有47种（表3），其中糖类化合物maltohexaose，maltopentaose差异倍数分别再67.12，59.01，生物碱如Alkaloid RC、Laurelliptine，SC中含量分别是TC的13.86，7.05倍，黄酮类化合物如rutin差异倍数为17.96，emodinanthranol差异倍数为35.18，甾醇如lucidone C差异倍数为190.65，这些物质都可作为区分2种栽培阶段金线莲的标识物，其中有些还是潜在的药用功能成分。TC含量较高的物质有36种（表4），变化较大的主要是有机酸如（R）-2-hydroxyhexadecanoic acid和3-dehydrosphinganine，差异倍数分别为9.23和7.98，另外叶黄素idoxanthin，TC中含量是SC的79.98倍。这些物质可以认为是区分2种栽培阶段金线莲的代谢标识物。

3.3 讨论

代谢物作为细胞调控过程的终产物，它们的种类和数量的变化被视为植物对基因或环境变化的最终响应，对这些化合物在动态、静态上进行全面地定性定量分析，即代谢组学研究。自1998年提出代谢组的概念以来，代谢组学发展迅速，受到各领域的广泛重视，具有广泛的应用前景。植物代谢组学作为代谢组学的重要组成部分，已逐步应用于基因功能的研究、代谢途径及代谢网络调控机制的解析等基础生物学的研究中[14-16]；也开始应用于作物的产量、营养成分等育种领域中[14]。代谢组学研究中，气相色谱适用于分析容易气化的低极性、低沸点代谢物，如各类挥发性化合物；或者衍生化后低沸点的物质，主要为初级代谢产物，单独使用GC-MS还不能全面揭示植物所有代谢物的变化。同GC相比，LC不受样品挥发性和热稳定性的影响，样品前处理非常简单，过滤后可以直接进样。因此，LC-MS可有效分析植物中丰富的次生代谢产物。在众多的质谱类型中，高分辨率的串联四级杆飞行时间质谱（quadrupole time-of-flight nass spectrometer，Q-TOF-MS）能最大程度地满足植物代谢组学研究的需要，LC-Q-TOF-MS已成功应用与番茄的代谢组学研究中[17]，系统地分析了番茄中中等极性的代谢物，结合保留时间、准确质量、紫外光谱和二级质谱信息，建立了番茄的代谢物数据库MoTo DB[18]。运用代谢组学的研究手段，采用GC-TOF-MS与UPLC-Q-TOF-MS相结合全面分析金线莲中的代谢物，为未知成分鉴定提供可能。

通过对金线莲代谢组学的初步研究，结果显示部分有机酸在TC中明显高于SC，这可能是由于组培苗生长环境优越及培养基营养丰富，使得金线莲初级代谢旺盛所致。金线莲苗移栽至土壤中之后，营养成分来源减少，初生代谢减弱，故SC与TC在形态上并无差异。UPLC-Q-TOF-MS分析结果显示，SC金线莲全株次级代谢产物的积累相对于TC有很大的提高。如：isorhamnetin，rutin，isorhamnetin triglucopyranoside，quercetin-3，4′-diglucoside，quercitrin，kaempferol-3-O-glucosyl-（1→2）-rhamnoside等黄酮及黄酮糖苷类化合物，研究表明这类化合物具有抗敏、抗炎、防止恶性细胞扩散及抗癌的特性[19-20]。nicotinamide riboside作为人体NAD+的前体物质，NAD+有助于抵抗神经系统降解、滑念珠菌感染及提高胆固醇逆向运输[21]。值得一提的是，hemorphin-4在组培金线莲中含量较高，这可能是除异亮石松碱之外金线莲中又一具有阵痛特性的成分[22]。由此推测，在组培壮苗出瓶后，继续进行土壤栽培，能够促使金线莲中黄酮等物质的累积。由于上述黄酮等物质比起有机酸等物质具有更高的药用价值，因此认为组培后再经土壤栽培的金线莲的品质更加优异。

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[责任编辑 丁广治]endprint