丹参酮ⅡA/β—环糊精包合物制备工艺优化及体外溶出性能研究

吴妮+于洁+张峡+曾敏+张亚军+郑晓晖

[摘要] 采用饱和水溶液法制备丹参酮ⅡA（Tan-ⅡA）与β-环糊精（β-CD）包合物，在单因素试验的基础上，以β-环糊精与丹参酮ⅡA的配比、包合温度和包合时间为自变量，包合物的收率、包封率和总评“归一值”为响应值，使用Box-Benhnken设计效应面法优化丹参酮ⅡA的包合工艺；采用红外光谱法（IR） 、核磁共振法（NMR）对包合物进行鉴定。结果表明，丹参酮ⅡA与β-环糊精包合物的最优制备工艺为：丹参酮ⅡA与β-环糊精的配比为1∶7， 包合温度为48 ℃， 包合时间为3 h； 采用优选的工艺条件制备丹参酮ⅡA与β-环糊精的包封率为 84.75%。丹参酮ⅡA与β-环糊精包合物可以明显提高丹参酮ⅡA溶出度。

[关键词] 丹参酮ⅡA； β-环糊精； 包合工艺； Box-Benhnken设计-效应面法； 体外溶出度

[Abstract] In this paper， tanshinone-ⅡA （Tan-IIA）/β-cyclodextrin （β-CD） inclusion complexes were prepared by saturated aqueous solution method. Based on the single factor experiment， Box-Benhnken design and response surface method were utilized to optimize the preparation procedures of tanshinone-ⅡA/β-cyclodextrin inclusion complexes. The ratio of β-CD to Tan-ⅡA， experimental temperature and time were defined as independent variables， while the yield of the inclusion complexes， encapsulation efficiency and the generalized "normalized value" were set as the response value. In addition， the inclusion complexes were characterized by infrared spectroscopy （IR） and nuclear magnetic resonance （NMR）. The results showed that optimum preparation conditions for Tan-ⅡA/β-CD inclusion complex were as follows： Tan-ⅡA/β-CD ratio of 1：7， the temperature of 48 ℃ and the time of 3 h. Under the optimized conditions， the encapsulation efficiency of Tan-ⅡA/β-CD inclusion complex was 84.75%. The Tan-IIA and β-CD inclusion complex can significantly improve the dissolution of Tan-ⅡA.

[Key words] Tan-ⅡA； β-CD； inclusion process； box-benhnkendesign and response surface method； dissolution in vitro

丹參酮ⅡA是中药丹参的主要脂溶性成分，具有抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤、治疗冠心病等方面的药理作用[1]，但是，丹参酮ⅡA在水中的溶解性差，口服生物利用度低，其动物血浆浓度远低于10 mg·L-1，且易被还原氧化，因此限制了其在临床上的应用[2-3]。β-环糊精具有“内亲脂、外亲水”的立体双亲性孔腔结构，能包络各种客体分子，作为药物载体能够增加药物的溶解度，减少药物的挥发和氧化[4-6]。郭睿[7]、樊丽[8]、Fan Yuexian[9]等对丹参酮ⅡA和β-环糊精包合物进行了研究，但他们主要侧重于研究其包合反应的热力学、包合常数及溶液的pH等对包合物的影响，并没有对包合工艺过程进行优化。Box-Benhnken设计-效应面法具有试验次数少，实验精度高的优点，适用于多指标实验考察[10]，本研究对β-环糊精包合丹参酮ⅡA工艺条件进行优化，并对包合物进行了红外、核磁表征，及体外释药性能。

1 材料

H01-1B数显恒温磁力搅拌器（上海美颖浦仪器仪表制造有限公司）；iChrom 5100系列高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）；H1650R台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；KQ5200DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；XS105DU型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Gemini 2000 （VnmrS 600 MHz）核磁共振仪（美国Varian）；NICOLET 5700红外光谱仪（美国Thermo）。

丹参酮ⅡA原料（西安华阳生物科技有限公司，纯度>97%）；丹参酮ⅡA对照品（中国食品药品检定研究院，批号110766-200417）；β-环糊精（天津市福晨化学试剂厂，批号为20120912）；甲醇、乙醇为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 丹参酮ⅡA-β-环糊精包合物的制备

取适量β-环糊精于水中，加热搅拌使其溶解，制成饱和水溶液。将溶解在少量无水乙醇中的丹参酮ⅡA缓缓加入β-环糊精的饱和水溶液中，设定适宜的温度，在适当的时间内连续在磁力搅拌器下搅拌（转速1 000 r·min-1）。将上述所得溶液冷藏 24 h后减压抽滤，分别用水和石油醚洗涤，真空干燥，得到橘红色结晶状固体包合物。endprint

2.2 标准曲线的建立

精密称定丹参酮ⅡA对照品3 mg，加3.0 mL甲醇，得到质量浓度为1.0 g·L-1的母液备用。然后分别取母液用甲醇稀释至质量浓度为0.5，1，5，10，15，20 mg·L-1的丹参酮ⅡA对照品溶液。用高效液相分别测定峰面积（流动相甲醇-水8∶2；检测波长268 nm），以丹参酮ⅡA质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），作图并进行线性回归，得回归方程y=58.566x-1.673 7，R2=0.999 7，结果表明丹参酮ⅡA在0.5～20 mg·L-1与峰面积线性关系良好。

2.3 方法学验证

2.3.1 精密度试验

分别选择0.5，20 mg·L-1丹参酮ⅡA对照品溶液在1 d内重复测定6次峰面积，得RSD 1.8%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

选择10 mg·L-1丹参酮ⅡA对照品溶液分别于2，4，6，8，10，12 h内测定峰面积，得RSD 2.4%，表明丹参酮ⅡA溶液在12 h内稳定。

2.3.3 专属性试验

分别制备丹参酮ⅡA对照品溶液、空白β-环糊精溶液、空白β-环糊精加丹参酮ⅡA对照品溶液。按照2.2项进行高效液相色谱分析，得到HPLC图见图1，通过比较图1中A，B，C图可知，所制备的样品中载体材料不会干扰丹参酮ⅡA的测定，表明建立的分析方法具有良好的专属性。

2.5 实验设计与工艺优化

响应面法（ response surface methodology，RSM） 是利用合理的试验设计方案，采用多元二次回归方程拟合各因素与响应值之间函数关系，通过对回归方程的分析优化工艺参数，预测响应值的一种统计方法[12-13]。

2.5.1 饱和水溶液法制备包合物的单因素试验

2.5.1.1 β-环糊精与丹参酮ⅡA的配比对包封率的影响 分别选取β-CD和丹参酮ⅡA的摩尔比例为4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，丹参酮ⅡA用适量无水乙醇溶解，将β-环糊精置于锥形瓶中，保持搅拌温度为50 ℃，搅拌时间为3 h不变，按2.1项下的方法进行制备包合物。按照2.4项下的方法，测定丹参酮ⅡA在β-环糊精包合物中的含量，按公式（2）计算包封率，实验结果见图2A。随着β-环糊精与丹参酮ⅡA的配比的增大，包封率明显上升，但上升到7∶1时，包封率达到最大值，随后随着β-环糊精与丹参酮ⅡA配比的增大，包封率开始下降。

2.5.1.2 搅拌温度对环糊精包封率的影响 选取β-CD和丹参酮ⅡA的摩尔比例为7∶1，丹参酮ⅡA用适量无水乙醇溶解，将β-环糊精置于锥形瓶中，固定搅拌时间为3 h，分别设定包合温度为30，40，50，60，70 ℃，按照2.1项下的方法进行制备包合物。按照2.4项下的方法，测定丹参酮ⅡA在β-环糊精包合物中的含量，计算包封率，实验结果见图2B。随着温度的上升，β-环糊精与丹参酮ⅡA包合物的包封率也不断上升，当温度达到50 ℃时，包封率达到最大值；随后随着温度的持续上升，环糊精与丹参酮ⅡA包合物的包封率开始下降。

2.5.1.3 搅拌时间对环糊精包封率的影响 选取β-CD和丹参酮ⅡA的摩尔例为7∶1，丹参酮ⅡA用适量无水乙醇溶解，将β-环糊精置于锥形瓶中，固定包合温度为50 ℃，分别搅拌1，2，3，4，5 h，按2.1项下的方法进行制备包合物。按2.4项下的方法，测定丹参酮ⅡA在β-环糊精包合物中的含量，计算包封率，实验结果见图2C。随着搅拌时间的增加，β-环糊精与丹参酮ⅡA包合物的包封率也在不断上升，当搅拌时间达到3 h时，包封率达到最大值，而在3 h之后，包合物的包封率随着搅拌时间的延长而有所下降。因为包合是丹参酮ⅡA缓慢扩散和借助分子间作用力进入β-环糊精空穴形成疏水键结合的过程，随着搅拌时间的增加，β-环糊精与丹参酮ⅡA包合物逐渐形成，并达到稳定状态，再增加搅拌时间，这种稳定状态已达到动态平衡，包封率不会增加，随着分子有序状态的形成，可能使已经包合的部分包合物解离，所以包封率反而有所下降。

2.5.2 Box-Behnken试验设计[14-15]

在单因素试验的基础上，选择对丹参酮ⅡA与β-环糊精包合物制备工艺影响最为显著的3个因素，即β-环糊精与丹参酮ⅡA的摩尔配比（X1）、包合时间（X2）、包合温度（X3）。每个因素分别设计低、中、高3个水平（以-1，0，1进行编码），以制备工艺的收率和包封率及其“归一值”OD为响应值进行Box-Behnken优化设计试验，试验设计编码及因素水平表见表1，实验数据结果见表2。

包封率与收率“归一值”OD：由于交互因素影响，造成当包封率较大时，而收率会降低，当收率较小时，包合率反而较大。因此，实验中引入一个综合指标归一值OD对工艺进行综合评价，即包封率与收率的综合评价指标，该值可反映总体效应结果。数据处理方法为“归一法”。在OD的计算过程中，每一个指标都标准化为0～1的“归一值”，各个指标的“归一值”，计算几何平均数（d1d2d3…dn），继而得OD，OD=（d1d2d3…dn）1/n，n为指标数，对于取值越小越好的因素和取值越大越好的因素采用Hassan方法分别进行数学转换，计算出“归一值” dmin以及dmax，dmin=（ymax-yi ）/（ymax-ymin），dmax=（yi-ymin）/（ymax-ymin）[16]。

2.5.3 丹参酮ⅡA/β-环糊精包合物制备工艺的效應面优化

用design expert8.0软件分析处理表2中的数据，拟合方差分析结果见表3。拟合回归方程按下式计算。

经F检验显示总模型方程达到显著水平（P<0.05），表明该试验方法可靠。回归方程失拟项不显著，说明未知因素对试验结果干扰比较小。复相关系数R2= 0.882 9说明该模型的拟合情况良好，能准确的预测实际情况。校正决定系数R2Adj=0.732 3，说明该模型能解释73.23%响应值的变化。二次项A2，C2的影响显著，说明二次项比一次项对响应值的影响大。故拟合的回归方程确定的最佳工艺是可用的，响应面分析立体图见图3。endprint

在試验水平范围内，随着时间的增加OD呈现 增加的趋势，表现为曲面较陡；而随着配比的增加和温度的增加OD呈现先增加后降低的趋势，表现为曲面较平缓。综合上述方差分析可知，影响大小次序为时间>配比>温度。

通过模型优化得到的最优条件为β-环糊精-丹参酮 ⅡA 7.125∶1，包合时间3.08 h，包合温度为48.8 ℃。考虑实际可操作性，最优条件可调整为β-环糊精-丹参酮 ⅡA 7∶1，时间3 h，温度48 ℃。在此条件下重复3次进行工艺验证。实际测得的包封率与预测值相差不大，说明此模型能较好的预测实际包封率。

2.5.4 工艺验证

为了验证所建立的模型与实验结果是否相符，需要进一步实验对模型的可靠性进行验证。按照以上优化工艺平行制备3批样品，收率与包封率的测定结果见表4。实际所得包合物收率与预测值相差0.4%（3批样品测定的平均值与预测值之差除以预测值），包封率与预测值相差1.1%。结果表明，该模型稳定可靠，可以较准确的预测实际值。

2.6 包合物表征分析

2.6.1 傅立叶变换红外光谱

用KBr将丹参酮ⅡA、β-环糊精、丹参酮ⅡA /β-环糊精物理混合物及包合物分别压片，在4 000～400 cm-1测试红外光谱，结果见图4。在物理混合物的图谱中，见图4C，吸收峰3 422.89 cm-1处明显为丹参酮ⅡA和β-环糊精的-OH吸收峰的叠加，而包合物D中的-OH吸收峰比较宽、强度明显降低，见图4D；相比于图4C，图4D丹参酮ⅡA1 650 cm-1处吸收峰明显降低。物质特征峰的变化证明了包合物的形成。

2.6.2 核磁共振波谱法

丹参酮ⅡA、β-环糊精、丹参酮ⅡA /β-环糊精物理混合物及包合物的核磁共振谱图见图5。核磁共振法是研究包合物形成、包合物空间构象强有力的方法，通过对比核磁共振图，能够获得主客体分子中一些原子化学位移的变化，1H-NMR是研究包合物形成最简单有效的方法[17]。H-3和H-5原子位于环糊精空腔内壁，当客体分子进入环糊精的空腔时，由于屏蔽作用，环糊精空腔内壁的H-3和H-5发生明显的化学位移，而环糊精外层的H-2，H-4，H-6原子则不受其影响，化学位移并不明显，由此可推断形成了包合物。

2.7 包合物的溶出度测定

ⅡA/β-环糊精包合物，运用响应面Box-Benhnken中心组合实验设计对其包合工艺进行优化，利用红外、核磁表征手段对所得包合物进行相关表征，实验结果表明包合物形成良好、包封率较高。最后体外溶出实验表明难溶性药物丹参酮ⅡA的溶出度增加1倍多，用β-环糊精包合丹参酮ⅡA可以明显提高丹参酮ⅡA的溶解度，从而提高丹参酮ⅡA的生物利用度。

国内外文献报道中，环糊精包合工艺常用正交或均匀设计的方法选择较佳工艺，由于试验次数少，数据处理和操作均比较简便，故其应用比较普遍，然而这2种方法的应用过程存在误区，他们是基于线性模型设计的方法，但实际上影响因素与效应值之间有时可能不是线性关系，若忽略这种情况进行简单的线性模拟，则会造成在很大程度上与真实值偏离。而Box-Benhnken中心组合实验设计一效应面法 （central composite design-response surface method，CCD-RSM ）作为一种新型的试验设计方法，具有试验次数少、精度高、预测值接近真实值等优点，其应用愈加广泛。本研究以饱和水溶液法制备的丹参酮ⅡA/β-环糊精包合物，其制备工艺简单，收率和包封率较高，有望实现规模化生产。另外体外溶出实验表明，环糊精包合物增加了难溶性药物丹参酮ⅡA的溶出度，较好的解决了丹参酮ⅡA的难溶性问题。

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[责任编辑 孔晶晶]endprint