反向分子对接技术在中药作用靶点预测、有效成分筛选及作用机制探索中的应用

关宏炜+徐丽君+董慧

[摘要] 中药现代化研究逐步成为世界性的潮流。反向对接技术也逐步成为中药现代化研究的有利工具，将一个小分子药物对接在一组临床相关大分子靶标的潜在结合腔中，通过对结合特征的详细分析，根据结合紧密程度对靶标进行排名，从而潜在地鉴定可能与其作用机制或副作用相关药物的新分子靶标。近年来，为了探索中药的作用机制、筛选中药有效成分以及寻找药物作用于疾病的靶点，反向分子对接技术被广泛运用并取得了瞩目的成绩。该研究通过文献综述，总结反向分子对接技术应用于中药作用靶点、有效成分筛选及中药潜在作用机制探索的情况，为中药临床研究及新药研发提供更多的理论依据。

[关键词] 中药； 反向分子对接； 对接软件； 数据库

[Abstract] Traditional Chinese medicine（TCM） modernization has gradually become a worldwide trend. Reverse docking technology has also gradually become a useful tool for TCM modernization. It involves docking a small-molecule drug in the potential binding cavities of a set of clinically relevant macromolecular targets. Detailed analysis of the binding characteristics was used for the ranking of the targets according to the tightness of binding. This process can be used to potentially identify the novel molecular targets for the drug which may be relevant to its mechanism of action or side effect.In order to explore the action mechanism， screen the active ingredients and seek the treating target of TCM， reverse molecular docking technology has been widely used and has achieved remarkable results in recent years. In this review， we summarized the application of reverse molecular docking technology in the target seeking， active ingredients screening and potential mechanism exploration of TCM， which may provide more scientific basis for the clinical research and development of new herbal drugs.

[Key words] traditional Chinese medicine； reverse molecular docking； docking software； database

目前，药物研发处于瓶颈时期，使用传统的“多个配体-单靶点”[1]的研发方法使得药物创新变得困难，发现一个新分子实体并应用于市场的成本超过20亿美元[1]，然而回报率却远远低于投资成本且耗时。“多个靶点-单配体”研究策略即反向分子对接技术有效的解决了这些难题，并成为药物重新定位的有利工具，尤其是在中药相关靶点筛选方面应用广泛。

中药治疗疾病的有效性有目共睹，且副作用小，但中药发挥治疗作用的成分及作用于疾病的相关靶点与作用机制仍然不明确。如何寻找中药治疗疾病的相关靶点，如何找到中药治疗疾病的有效成分，如何预测中药潜在的作用机制，是科研人员面临的亟待解决的难题。反向分子对接技术[2]是基于分子对接技术之上，是分子对接技术的逆向思考，它以小分子或者化合物作为探针，在具有三维结构的靶点数据库内进行对接，通过空间匹配和计算小分子与靶点之间的能量，对小分子化合物作用靶点进行筛选，从而预测药物作用的潜在靶点。反向分子对接技术基于“锁钥匙模型”[3]，在一组与临床相關的大分子靶标结合腔中插入小分子药物配体，根据结合紧密程度对靶标蛋白质进行排名。反向对接以药物小分子或者化合物作为探针，在已知的靶点数据库里面搜索可能与之结合的生物靶点大分子，通过空间和能量匹配相互识别形成复合物，鉴定药物潜在的作用机制以及副作用或者配体的分子靶标。现将反向分子对接技术及其在中药作用靶点、中药有效成分筛选及中药潜在作用机制预测中的应用进展予以综述。

1 反向分子对接有关数据库介绍

反向分子对接技术需要在数据库中搜索相应的小分子及生物大分子的分子结构。搜索相关文献，得知小分子结构数据库包括[4-6]：中药小分子数据库（TCM Database@Taiwan，CNPD，CHCD，CHDD，BPCD，TCM-ID，TCM-PCD，CHMIS-C，GPNDBTM，CEMTDD，CVDHD，Chem-TCM）及其他小分子结构数据库（PubChem，ZINC，DrugBank，NIH Chemical Genomics Center Pharmaceutical Collection，World Drug Index，ChEMBL数据库）等。其中TCM Database@Taiwan[7]可在http：//tcm.cmu.edu.tw/中搜索获得，TCM-PCD获取的地址是http：//pharminfo.zju.edu.cn/ptd；CHMIS-C可以通过http：//sw16. im.Med.umich.edu/chmis-c/获取；PubChem[8]通过 https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov获得，是2004年发布的化学物质及其生物活性信息的公共存储库。endprint

疾病相关靶点数据库[4] PDTD，PDB，TTD，BindingDB，KiBank，AffinDB，MMDB，TargetBank，sc-PDB，PDBbind，RELIBASE等。其中数据库PDTD[9]（蛋白质药物靶标数据库）具有已知3D结构的药物靶点，可在http：//www.dddc.ac.cn/pdtd/上在线获取；PDB[10]（蛋白质数据库）包含7万多个蛋白质结构信息，该数据库可在http：//www.rcsb.org/pdb/访问；TTD[11]（治療靶标数据库）可在http： //bidd.nus.edu.sg/group/cjttd /TTD.asp访问。

2 反向分子对接技术的发展进程及其相关软件简介

2.1 对接软件INVDOCK

对接软件是分子反向对接中必不可少的一部分，首款反向对接软件INVDOCK，可自动鉴别小分子蛋白质和核苷酸靶点。此软件主要用来预测药物的潜在毒性和副作用，提供药物的可能治疗靶点，以及检测在中草药和配方中一组分子的协同作用。因操作过程相对繁琐，很少作为对接软件的首选。

2.2 对接软件TarfisDock

在INVDOCK基础之上开发出一款比较简快捷的软件TarfisDock[12]，它是中国科学院上海药物研究所蒋华良课题组开发的药物靶点预测的免费公共平台。通过搜索数据库PDTD，在数小时的时间里就可以找到小分子作用靶点，可在http：//www.dddc.ac.cn/tarfisdock/搜索。然而，Tarfis Dock仍然有一定的局限性[12]：蛋白质条目不足以覆盖疾病相关基因组的所有蛋白质信息，反向对接的评分功能不够准确。

2.3 对接软件 PharmMapper

继TarfisDock之后，一款免费网络服务器PharmMapper[13]问世，是基于TargetBank，DrugBank，BindingDB，PDTD四大数据库进行靶点的搜索，可以在http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/上免费获得。但是PharmMapper仍然存在一定局限性：药效团数据库仅包括具有共结晶配体的PDB结构的药物靶标。

2.4 对接软件ReverseScreen3D

ReverseScreen3D[14]由英国丽兹大学Jackson RM课题组研发，ReverseScreen3D可以在http//www.modelling.leeds上免费获得。主要限制是人类基因组以及其他与疾病有关基因组的结构覆盖率差。

2.5 对接软件idTarget

idTarget[15]是一款在线免费服务器，用于识别化学小分子的生物分子靶标的网络服务器，具有强大的评分功能，可以在http：//idtarget.rcas.sinica.edu.tw免费获得；此软件已经成功应用于蛋白激酶抑制剂和他汀类药物靶点的预测[16-17]。

2.6 对接软件AutoDock

AutoDock[18]由Scripps研究所的Olson实验室开发与维护，运用拉马克遗传算法来计算配体与受体之间最佳的结合状态[19]；AutoDock软件由 AutoGrid 和 AutoDock 2个程序组成，还具备分子可视化辅助对接软件AutoDock Tools（ADT）程序[20]，在http：//autodock.scripps.edu/上直接下载即可安装。

3 反向分子对接技术在中药靶点预测、有效成分筛选及毒副作用机制等方面的研究

关于中药潜在靶点预测的文献报道层出不穷，中药成分的复杂性致使其作用靶点的多样性，即使用指纹图谱等试验方法得到中药的主要成分，通过虚拟筛选等手段也很难得到“一药一靶”或者“一种成分一个靶点”的结果。中药有效成分及其药理作用的报道不计其数，但是绝大多数的作用机制不详，部分药物的药理成分即使被证实，其有效成分的药理活性、作用机制仍然不清楚，发现药理活性的过程十分艰难；药物安全评估是新药开发的主要课题，动物实验和临床试验的目标之一是评估候选药物的毒性和副作用，然而用于药物开发的这些试验耗费了大量的时间和金钱，且成功率较低[1]。临床上少用单味中药而多用复方治疗疾病，很难判定发挥疗效的是单味中药还是多味中药的协同作用，基于中药成分复杂性、多样性的特性，阐明中药发挥疗效成分的作用机制需要用更精确的科学数据。反向分子对接技术很好的解决了这一难题，“多靶点-单配体”对接模式根据空间和能量匹配，小分子化合物与生物大分子相互识别形成分子复合物，从而预测药物潜在作用靶点、药物潜在的作用机制、新药毒性及副作用以及中药复方作用机制，节约成本和时间。

3.1 反向对接技术在中药潜在靶点预测方面的应用

3.1.1 在中药治疗心血管疾病靶点预测方面的应用 在心血管疾病治疗用药方面，中药发挥着不可忽视的作用，但是作用靶标尚不明确，反向对接技术为药物潜在靶点的预测提供了新思路[21]。研究人员[22]运用INVDOCK软件，建立表皮生长因子到丹酚酸B信号相关蛋白的信号网络，阐明了丹酚酸B治疗心血管疾病方面的机制，与表皮生长因子是丹酚酸B的直接作用靶标有关。有研究[23]为了探讨丹酚酸B对阿霉素诱导心肌细胞毒性的保护作用及其可能的作用靶标蛋白，运用PharmMapper进行反向对接，预测相关作用靶点，用AutoDock做正向对接以验证反向对接结果，得出结论丹酚酸B对阿霉素诱导的心肌细胞有一定保护作用，作用靶点可能是调控丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 12 和 DNA 拓扑异构酶 2。Zhao Jing等[24]通过中药黄芪提取物黄芪甲苷的研究，采用INVDOCK软件，从DrugBank中下载与心血管疾病相关的药物以及相应的靶标，构建药物靶点网络，在39个预测目标中验证了3个相关性极高的靶点：钙调神经磷酸酶（CN），血管紧张素转换酶（ACE）和c-Jun N-末端激酶（JNK），为进一步证实黄芪甲苷治疗心血管疾病的机制提供依据。endprint

3.1.2 在中药抗肿瘤靶点预测方面的应用 在中药抗肿瘤靶点预测方面，反向分子对接技术发挥了重要作用，有研究人员[25]运用AutoDock和Tarfisdock 2种对接软件，实施2个单独的计算机工作流程，从PDTD蛋白数据库中筛选出几种具有抗肿瘤作用的临床重要蛋白质作为2种方法的潜在受体，预测茶叶抗肿瘤的潜在靶点。通过实验证实EGCG潜在抗肿瘤的受体有谷胱甘肽还原酶，过氧化氢酶和eEF1-α等，还包括常规的抗肿瘤靶点如角鲨烯氧化物环化酶，白三烯A4水解酶（LTA4H）等；本研究為EGCG及其衍生物的抗肿瘤机制和新靶向药物设计研究提供了重要信息。研究茶叶功能组分ECG，EGC，EC，EGCG的抗肿瘤机制。Chen Shao-Jun等[26]使用PharmMapper和idTarget服务器作为工具，并用PyRx 0.8中的分子对接程序AutoDock Vina检查结果，得出丹参素的潜在抗癌靶标可能是HRas。Jeong Chul-Ho等[27]在PDTD数据库中搜索与肿瘤相关的靶点，运用TarfisDock软件对姜的天然成分姜黄素进行反向对接，发现白三烯A4水解酶（LTA4H）是姜黄素抗肿瘤的靶点。陈少军等[28]以丹参醇A为研究对象，以PharmMapper为反向对接工具，发现了丹参醇A与靶蛋白醛糖还原酶的打分靠前，用正向对接验证发现丹参醇A与醛糖还原酶有相互作用，阐明了丹参醇A的抗肿瘤靶点可能是醛糖还原酶。

3.1.3 在中药治疗其他疾病靶点预测方面的应用 Chen Shao-Jun等[29]运用PharmMapper对丹参酮ⅡA进行反向对接，运用AutoDock Vina在PyRx 0.8中进行验证，得出结果视黄酸受体α（RARα）可能是丹参酮ⅡA对急性早幼粒细胞白血病APL的潜在靶标。刘秀峰等[30]采用AutoDock4.2进行反向对接，利用AutoGrid程序产生网格地图，研究对象雷公藤内酯醇及其3种相似物的三维立体结构利用软件Discovery Studio 2.5绘制并且优化，对于相互作用的可视化以及蛋白和配体间的分子结构和氢健采用软件Discovery Studio 2.5完成；将3个化合物对接到多个核受体类蛋白（NRs）的活性位点上，确定雌激素受体α为其作用靶点，并且通过体外重组和其他的实验进行了验证。Hsieh Sheng-Kuo等[31]运用Discovery Studio 2.1对生长激素促分泌素受体进行同源建模，选择PDF总能量最低的生长激素促分泌素受体（GHSR）结构进一步对接生长激素释放激素-6（GHRP-6）和银杏叶素；GHRP-6的3D结构从PubChem数据库下载，银杏叶素3D结构在Chem3D程序上创建，银杏叶素和GHRP-6与GHSR的对接过程在Discover Studio 2.1中的LipDock组件上完成；分子建模和对接显示，Ginkgoghrelin以及GHRP-6可以适应并充分与生长素释放肽受体的结合袋相互作用。表明Ginkgoghrelin可能通过活化生长素释放肽受体影响银杏的抗衰老作用，并且具有很大的潜力被开发为生长素释放肽的非肽类似物。

3.2 反向分子对接技术在阐明中药效应成分与靶标的作用及其相关机制的应用

3.2.1 在阐明中药效应成分与肿瘤相关靶标的作用机制的应用 反向分子对接除了预测小分子化合物作用的靶点，还可以通过已知的小分子化合物的药理作用和相关的靶标进行对接，从分子水平阐明中药效应成分与靶标的作用机制。有研究人员[32]利用AutoDock Vina对土贝母皂苷甲进行反向对接，发现其与多个抗肿瘤靶标具有很高的亲和力，为进一步研究土贝母皂苷甲抗肿瘤机制提供了依据，同时也预测到贝母皂苷甲具有抗肿瘤的作用。成功预测土贝母皂苷可以通过抑制酪蛋白激酶Ⅱ、金属基质蛋白酶-8、Src激酶、胸苷酸合成酶、CDK2以及微管蛋白的活性，发挥抗肿瘤的作用。Biplab Bhattacharjee等[33]利用idTarget和PharmMapper 2种虚拟筛选的方法对藏红花有效成分的抗肿瘤靶点进行筛选，从而预测藏红花生物活性成分的抗肿瘤机制。具体采用Fitscore 和Binding能量分级对对接结果进行分析，得到一组与多种形式的癌症相关蛋白，结果的有效性通过AutoDock软件对藏红花苦苷及Hsp90α对接形态进行详细分析验证；藏红花生物活性成分（藏花酸、藏花醛、藏红花苦苷）小分子结构（sdf文件格式）从PubChem数据库中获得，在MarvinSketch中将格式转换成moll格式，药效团模型从PharmTargetDB中得到；利用AutoDock试验再现，从RSCS-PDB（PDB ID：4EGI）检索的Hsp90α和其内置的结晶配体B2J的结构与Hsp90重新对接。比较了原始B2J-Hsp90α复合物与后置对接模拟B2J-Hsp90α复合物结合姿势的分子相互作用，找出了研究中AutoDock作为相互作用工具的可靠性，进而验证了藏红花生物活性成分及其抗肿瘤机制的可靠性。

3.2.2 在阐明中药效应成分与炎症相关靶标的作用机制的应用 研究人员[34]以炎症通路上30个验证蛋白为研究对象，从Pubchem上下载的大黄酸的结构信息，通过软件AutoDock使大黄酸与炎症通路上的蛋白进行对接，得到3个与大黄酸具有高亲和性的靶蛋白：p38MAPK，PI3K7，JAK2，比较对接自由能，得出大黄酸发挥抗炎作用的机制是通过抑制p38MAPK，PI3K7，JAK2靶蛋白，从而阻碍炎症信号传递，影响下游蛋白的表达，发挥抗炎作用。还有研究人员[35]用软件ChemBioOffice中的ChemBioDraw和Sybyl-X1.1对车前草34个化合物的二维结构和cx2，lpxx，4cox进行分子对接，cx2，lpxx，4cox从PDB数据库里面下载，并且经过试验证明具有明确的抗炎作用，对接结果显示排名前7位的化合物依次为桃叶珊瑚苷、车前草苷B、阿魏酸、6-羟基木犀草素、芹菜素、京尼平甙酸、梓醇的对接得分最高，进一步阐明了车前草化合物的抗炎机制。徐佑东等研究者[36]以黄连碱为研究对象，运用对接软件AutoDock，对TLR4/NF-κB，p38MAPK，JAK2/STAT33条通路上的蛋白进行反向筛选，最终筛选出4种与黄连碱具有高亲和力的靶标蛋白：PI3Kδ，PI3Kγ，IKKβ，PI3Kα；阐明黄连碱可以通过抑制这4个靶蛋白进而阻碍炎症信号传递，发挥抗炎作用。endprint

3.3 反向分子对接技术在评价药物毒副作用机制中的作用

药物的毒副作用在新药的筛选中起着决定性的作用，研发的新药是否上市及上市的药物是否被撤市，取决于该药物的不良反应，反向对接技术可以快速的预测出药物的毒副作用，有利于降低药物研发的成本，减少新药研发的时间。Chen Y Z等[37]运用INVDOCK对数据库中与毒性和副作用相关的蛋白靶标进行自动搜索，对阿司匹林，青霉素，布洛芬等药物的3D结构进行对接，发现了这些药物的毒副作用。他们[38]还通過与 TTD，DART 和 ADMEA 三大药物潜在靶点数据库相连，成功对四氢他莫昔芬和维生素E的作用靶点、毒性和副作用以及代谢特征进行了预测。

3.4 反向对接技术在阐明中药复方作用机制中的应用

反向对接技术不仅在单味中药靶点预测以及作用机制研究中占有重要地位，在中药复方研究中也有一定的涉足。高耀等[39]通过DrugBank 数据库中 FDA 批准抗抑郁药物靶点的比对筛选，借助 MAS3.0 生物分子功能软件靶点信息的注释，采用 Cytoscape 软件构建逍遥散成分-靶点-通路网络，阐明了逍遥散抗抑郁作用体现了中药多成分、多靶点、多途径的作用特点，其成功地依据反向药效团匹配方法预测25 个可能与逍遥散治疗抑郁症相关联的潜在作用靶点。程彬峰等[40]利用PharmMapper等生物信息学手段对清肺消炎丸的化学成分进行吸收、靶点及作用通路的预测分析； 并结合豚鼠哮喘模型和人支气管上皮细胞炎症模型，采用基因芯片研究其对相关炎症基因表达的影响，以此建立了“药物-靶点-通路-网络 ”的研究模式，初步揭示了清肺消炎丸能通过影响 ERK1 等基因的表达进而干预黏着斑，Fc epsilon RI，Toll样受体，NK细胞介导的细胞毒以及 ERK/MAPK等 5 条通路发挥抗炎作用。刘昌孝等[41]利用PharmMapper建立元胡止痛滴丸中 28 个入血成分的化合物-靶蛋白网络，通过KEGG数据库对获取的靶点及相关通路进行分析，利用 Cytoscape 软件构建元胡止痛滴丸的“化合物-靶点-通路-疾病”网络图，得知元胡止痛滴丸可能通过激素调节、中枢镇痛、解痉、炎症及免疫相关的蛋白靶点及通路，起到镇静止痛的治疗作用。

4 展望

现阶段对中药的现代化研究已经进入了一个新时期，运用现代科学技术与传统中医药理论相结合，阐明中药的作用机制以及药理作用，是中药研究突破的中药思路，反向分子对接为中药研究提供了一个新思路，在中药研究领域的优势逐渐显现出来。通过评分功能以及能量匹配的方式，“单配体-多靶点”或者“一种化合物成分-一个靶点”的对接模式，能快速地找到药物作用的相关靶点，进而探索中药成分治疗疾病的作用机制。另外，对接程序的不断优化以及数据库的不断完善，加快了药物研究的进展，节约药物研发的投资成本。但是反向分子对接也有一定的局限性，计算机模拟对接数据不能完全代替体内实验数据；对接分数高，亲和力高的不一定就说明配体作用较好，还需要与其他实验方法相结合，利用生物实验进行验证。另外对接软件的复杂性及多样性，以及中药本身结构和成分的复杂性，数据库的更新速度慢，让很多刚入门的学者耗费大量精力，但是随着理论和技术的不断完善，反向分子对接在中药中的运用将会再次迈入一个新阶段。

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[责任编辑 张宁宁]endprint