基因芯片技术在慢性HBV感染者病毒基因分型和耐药基因检测中的应用及临床意义

周冬青+王骥+赵娴+陈辉

[摘要] 目的 采用基因芯片检测徐州地区慢性HBV感染者病毒基因分型和耐药基因，并研究其应用价值及临床意义。方法 收集徐州市传染病医院2015年5月—2017年7月在徐州市传染病医院肝炎科就诊的34例临床确诊为慢性HBV感染且有抗病毒药物应用史且治疗效果不佳患者的临床资料和患者的血清样本，采用基因芯片技术对样本进行乙肝病毒基因分型和耐药突变的检测，将检测结果结合患者的临床资料进行分析，判断其应用价值及意义并指导临床用药。结果 34例患者检出HBV DNA阳性为32例，阴性2例，阳性患者中HBV-C型患者26例，HBV-B 型患者3例，HBV-B合并HBV-C患者3例；LAM+Ldt耐药4例，为2例C型、1例B型、1例B、C合并型；LAM+Ldt+ADV 3例，均为HBV-C型患者；LAM+Ldt+ETV耐药患者5例，均为HBV-C型；总计12例耐药患者中含有rtL180M和rtM204I/V突变有8例，rtA181V/T突变有3例，1例为rtM204I/V+rtT184A/I/L/S/F/G突变，4例除rtL180M和rtM204I/V突变还出现rtS203G/I，还有1例rtL180M和rtS202G/I突变。 结论 采用基因芯片检测乙型肝炎患者的基因分型和耐药基因，具有重要的应用价值，对指导临床抗病毒治疗具有十分重要的意义。

[关键词] 基因芯片；乙型肝炎病毒基因型；耐药基因突变；核苷类似物

[中图分类号] R440 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）10（b）-0034-04

[Abstract] Objective This paper tries to analyze the application and clinical significance of gene chip technology in detection of viral genotypes and resistances genes in chronic HBV infected patients in Xuzhou area. Methods Clinical data and serum samples of 34 patients with chronic HBV infection and antiviral medication history and poor treatment effect from hepatitis department of Xuzhou infectious diseases hospital from May 2015 to July 2017 were studied， detection of hepatitis B virus genotypes and drug resistance mutations by gene chip technology were carried out， the detection results combined with the clinical data of patients were analyzed， its application value and the significance were determined and the clinical therapy was guilded. Results 32 cases were HBV DNA positive among the 34 patients， 2 cases were negative， 26 cases of patients with type HBV-C ， 3 cases of patients with type HBV-B， 3 cases of patients with type HBV-B and HBV-C. 4 cases of LAM+Ldt resistance， 2 cases of type C， 1 case of type B， 1 case of type B and C. 3 cases of patients with LAM+Ldt+ADV， all of which were HBV-C type. 5 cases of patients with LAM+Ldt+ETV resistance were HBV-C type. A total of 8 cases of drug resistance patients containing rtL180M and rtM204I/V mutation in 12 cases， 3 cases of rtA181V/T mutation， 1 case of rtM204I/V+rtT184A/I/L/S/F/G mutation， 4 cases in rtL180M and rtM204I/V mutations as well as rtS203G/I， and 1 case of rtL180M and rtS202G/I mutation. Conclusion Gene chip for genotyping and drug resistance genes in hepatitis B patients has important application value and is of great significance in guiding clinical anti-virus treatment.

[Key words] Gene chip； Hepatitis B virus genotypes； Drug-resistant gene mutation； Nucleoside analogue

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性分布，全球约有3.5亿感染者。我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9 300万例，每年约有30万死于与HBV相关的肝脏疾病所致的肝硬化、肝癌等严重肝病[1]。根据DNA序列差异，目前，HBV可分为A-J 10种基因型[2-3]，其中，我国以B型和C型为主。不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异。针对慢性HBV感染的治疗方法主要是抗病毒治疗，目前主要有干扰素和核苷（酸）类两类药物。由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，而核苷（酸）类药物因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的乙肝患者等优点，核苷（酸）类药物已是抗HBV治疗的主要手段[4]，但是，隨着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株[5-6]，因而需要对病毒耐药基因进行监测，以指导临床用药。目前乙型肝炎病毒基因分型法及耐药基因检测方法大多采用基因扩增以后的测序方法完成，一般的医疗单位不具备测序条件，无法进行核酸比对分析，因而不适于基层医院的推广应用。乙肝病毒的逆转录复制机理使得乙肝病毒变异较为常见。内源性和外源性选择压力下很容易产生免疫逃避变异株[7-8]。基因芯片为采用光导原位合成及显微印刷将大量特定序列探针密集有序的固定于载体上，通过多元杂交进行定性及定量的方法。微型化、集成化、高通量，平行化及敏感性强为其主要特点[9-10]。为此方便收集徐州市传染病医院2015年5月—2017年7月在徐州市传染病医院肝炎科就诊的34例临床确诊为慢性HBV感染且有抗病毒药物应用史且治疗效果不佳患者的临床资料和患者的血清样本，采用基因芯片技术对样本进行乙肝病毒基因分型和耐药突变的检测，将检测结果结合患者的临床资料进行分析，判断其应用价值及意义并指导临床用药，现报道如下。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便收集34例徐州市传染病医院收治的乙型肝炎患者血液标本及临床资料，所有患者均服用过核苷类似物或正在服用核苷类似物进行抗病毒治疗；其中男性25例，女性9例；年龄31～87岁，平均44.33岁，所有患者均根据2015年《中国慢性乙肝防治指南》诊断标准[11]具有明确诊断，初次应用抗病毒药物患者除外，HBV DNA含量均大于103。患者清晨空腹采取血液3～5 mL，待测样本离心后取血清存放与-20℃冰箱。

1.2 主要仪器和试剂

仪器：核酸提取仪、荧光定量PCR仪、分子杂交仪、冰箱。试剂：核酸提取试剂盒、HBV DNA 荧光定量检测试剂盒（福建厦门安普利生物有限公司，下限为103IU/mL）、乙肝病毒基因分型及耐药检测基因芯片。

1.3 方法

26例患者的血清标本均采用荧光定量PCR和基因芯片2种方法进行检测，将2种方法检测的结果结合患者的临床资料与其他实验室检查（肝功能、血清免疫标志物、肝纤维检测等）结果综合分析，判断其应用价值，以便根据检测结果更合理地为患者用药。核酸提取及荧光定量PCR检测方法严格按照说明书进行操作。基因芯片技术检测乙肝病毒基因分型及耐药基因亦严格按照说明书进行操作，并根据实际实验室条件，进行优化操作方法，保证检测结果可信，具体包括以下操作步骤：①DNA提取：取20 μL蛋白酶K加入编号的1.5 mL离心管中，然后加入200 μL血清和200 μL裂解液，上下颠倒混匀；置56℃恒温水浴中10 min后加入300 μL无水乙醇并混匀，缓慢转移上述液体至离心柱中央，12 000 rpm离心1 min，弃滤液加入700 μL洗液Ⅰ（用前加入无水乙醇），洗涤后弃滤液，加入700 μL无水乙醇，弃滤液，干燥，洗脱，保存备用。②PCR扩增：取出含PCR扩增反应液的PCR管，编号后离心5 s，加入待测样本1.5 μL，5 000 rpm离心2 s，放入PCR仪扩增，PCR程序设置：50℃ 2 min，95℃10 min；94℃ 60 s+68℃ 90 s 30个循环；94℃ 30 s+54℃ 30 s+72℃ 30 s 30个循环；72℃ 5 min，12℃保存。③杂交、结果判读：膜条、6 mL的A液和对应的PCR产物加入离心管，沸水浴10 min变性，取出离心管放入杂交箱进行杂交，将膜条放入B液洗涤，放入孵育液室温孵育，膜条放入A液摇洗2次，放入C液洗涤1次，现配显色液，避光显色；纯净水或去离子水洗涤至少1次，判读结果，4℃保存膜条。④结果判读：rt180M和rt204I/V、rt204I/V、rt181V/T、rt207I位点突变为拉米夫定（LAM）耐药，rt180M和rt204I/V、rt204I/V、rt181V/T位点突变为替比夫定（Ldt）耐药，rt181V/T和rt236T突变为阿德福韦酯（ADV）耐药，rt180M和rt204I/V、rt204I/V以及rt184I/S/A/F/L/G、rt250I/L/V、rt202G/I位点突变为恩替卡韦（ETV）耐药。

2 结果

34例患者检出HBV DNA阳性为32例，阴性2例，阳性率94.11%，与荧光定量PCR检测结果基本一致。

32例阳性患者中HBV-C型患者26例，HBV-B 型患者3例，HBV-B合并HBV-C患者3例，HBV-B 型患者3例，HBV-B合并HBV-C患者3例与。说明徐州地区患者主要。

34例患者检出12例耐药患者，耐药检出率35.2%，其中LAM+Ldt耐药4例，为2例C型、1例B型、1例B、C合并型；LAM+Ldt+ADV耐药3例，均为HBV-C型患者；LAM+Ldt+ETV耐药患者5例均为C型。

12例出现基因突变的耐药患者中rtL180M和rtM204I/V突变有8例，rtA181V/T突变有3例，1例为rtM204I/V+rtT184A/I/L/S/F/G突变，4例除rtL180M和rtM204I/V突变还出现rtS203G/I，还有1例rtL180M和rtS202G/I突變。这12例耐药突变患者曾长期使用核苷类似物进行抗病毒治疗，起初效果较好，肝功能较快恢复正常，HBV-DNA下降速度较快，患者用药48周后出现肝功能异常，HBV-DNA大于104，甚至高达106，ALT反复异常，患者病情出现了反跳，因此检测结果与临床基本一致。

采用基因芯片检测乙型肝炎患者的基因分型和耐药基因，具有重要的应用价值，对指导临床抗病毒治疗具有十分重要的意义。

3 讨论

目前乙型肝炎病毒耐药变异的检测与分析主要有以下几种方法：①PCR产物直接测序法：该技术一次可准确测序HBV逆转录酶A-E区的全长549bp，通过一次实验能检测全部已知和可能的耐药变异位点。但是该法灵敏度较差，只有当变异株超过20%时才能被发现。②聚合酶联反应-限制性片段长度多态性：该方法敏感性较强，可检测数量为5%耐药变异株，然而只能检测单位点变异，随着多种核苷类似物的应用和HBV变异位点的不断出现，该方法难以满足临床要求。③反向杂交法：该法敏感性较强，可检测占HBV准种池5%～10%的耐药变异样品，信息量大，自动化高。但仪器、试剂昂贵，操作复杂，因此难以用于临床。④实时PCR方法：该法可检测变异率大于10%的耐药变异，但仅能检测单位点变异。⑤基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱：该技术是近年来发展的一种软电离新型质谱，已成为检测鉴定多糖、蛋白质、核酸、糖蛋白等有力工具，具有灵敏性高、准确、分辨率高特点，可发现数量不足1%HBV变异株，但设备昂贵、难以应用于临床。基因芯片是一种新型检测技术，与上述其他各种方法比较，不但具有快速、高效、敏感、平行化、自动化等优点，而且不需要昂贵的测序仪、激光解吸电离时间质谱仪等仪器，操作简单，结果判断直观可见。endprint

研究结果发现12例出现基因突变的耐药患者中rtL180M和rtM204I/V突变有8例，rtA181V/T突变有3例，1例为rtM204I/V+rtT184A/I/L/S/F/G突变，4例除rtL180M和rtM204I/V突变还出现rtS203G/I，还有1例rtL180M和rtS202G/I突变。说明rtL180M和rtM204I/V是最常见的基因突变位点，而且rtL180M位点突变常合并rtM204I/V基因位点突变。刘健等[12]在《拉米夫定和阿德福韦酯抗病毒疗效与HBV 基因型关系》一文中对乙肝病毒耐药基因位点检测结果认为， 拉米夫定组耐药基因位点主要为rtL180M，其次为rtM204I/V； 阿德福韦酯组耐药基因位点为rt236T，其次为rt181V/T；这与该次的研究结果不尽相同，该次研究结果发现多数患者出现两个位点以上同时突变，由于随着抗病毒药物应用种类增多和应用范围扩大，乙型肝炎病毒会出现耐多药基因，这对于临床如何选择更合适抗病毒治疗方案是一种崭新的挑战。

研究中发现12例患者均对LAM和Ldt耐药，3例合并ADV耐药，5例合并ETV耐药，这可能LAM应用最早（1998年美国FDA第一个批准的抗乙肝病毒药物）且应用最广泛有关（价格相对较低），鉴于LAM耐药率较高的原因（经过连续5年的治疗， 约70%的患者会出现耐药[13]）， 替比夫定也被作为一种常用的抗病毒药物，一旦患者出现LAM耐药，对Ldt也会耐药，如果使用Ldt治疗将无效；对于LAM耐药患者常联合ADV用于抗病毒药物治疗以提高抗病毒药物疗效，因此使部分联合用药患者在LAM耐药基础上出现了LAM与ADV同时耐药，近年来有学者认为恩替卡韦能够强效抑制乙肝病毒，且耐药率低[14]，该次研究发现12例耐药患者中有5例出现了ETV耐药，说明随着ETV的推广应用，ETV耐药率正在增加；因此急需研究新的耐药率极低的抗病毒药物以便更好地抑制乙型肝炎病毒。

研究发现32例阳性患者中HBV-C型患者26例，其中突变的患者中有2例为B型，其余均为C型，由于C型基因患者多于B型基因患者，因此C患者基因耐药突变率多于B型基因患者并不能说明C型基因容易突变，由于样本例数太少，尚无法进行统计学分析，需扩大样本进一步研究。

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（收稿日期：2017-08-18）endprint