基因FOXP2与高功能孤独症儿童的病例对照研究

张文茂+彭赞平+邬洪梁

[摘要] 目的 探讨FOXP2基因的2个单核苷酸多态性（SNPs）位点rs121908377、rs121908378与高功能孤独症儿童之间的相关性。 方法 方便选取2016年1月—2017年1月在该院儿童保健科确诊的100例高功能孤独症儿童（病例组）及同期在儿童保健科体检中心体检的120名身体及精神均健康儿童（对照组），应用基因芯片及PCR-测序方法对病例组及对照组的rs121908377、rs121908378 位点进行基因分型，对所获分型数据进行病例对照关联分析。结果 从病例组中随机选取的高功能孤独症儿童的基因芯片结果为阴性，病例组FOXP2基因的2个SNPs 的基因型频率为0.960、0.970，对照组的2个SNPs基因频率为0.958、0.958，分布均未偏离哈德温伯格平衡（P>0.05）；FOXP2基因的rs121908377、rs121908378位点的基因型频率在病例与对照间比较差异无统计学意义（P>0.05）。 結论 FOXP2基因的rs121908377、rs121908378位点的单核苷酸多态性与高功能儿童孤独症不相关。

[关键词] 高功能孤独症；FOXP2基因；PCR-测序法；病例对照研究

[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）10（b）-0001-03

[Abstract] Objective This paper tries to explore the correlation between the rs121908377， rs121908378 SNPs of the FOXP2 gene and the high functioning autism. Methods From January 2016 to January 2017， 100 children with high functioning autism （the case group） and 120 normal children both physically and mentally healthy in the same period （the control group） were convenient selected from this hospital. The rs121908377， rs121908378 SNPs of FOXP2 was genotyped by PCR-Sequencing in individuals with high functioning autism and normal subjects. A correlation study was performed by using the data of genotyping. Results The results of the gene chip of the highly functional autistic children randomly selected from the case group were negative， the frequencies of two SNPs in the genotypes were 0.960 and 0.970 in the case group， 0.958 and 0.958 in the control group， all were in Hardy-Weinberg equilibrium （HWE） （P>0.05）. There were no significant differences in allele frequency of the FOXP2 gene of rs121908377， rs121908378 between the high functioning autisms group and normal control group （P>0.05）. Conclusion The SNPs of rs121908377， rs121908378 of FOXP2 gene were not associated with high functioning autism.

[Key words] High function autism； FOXP2 gene； Polymerase chain reaction-Sequencing； Case-control study

孤独症（autism），又称自闭症，是PDD （Pervasive developmental disorder，广泛性发育障碍）的代表性疾病，三大特征为刻板行为、语言障碍及社交障碍[1]。ASD一般3岁前发病并携带终生，男性发病率为女性的4～6倍，我国的儿童孤独症患者约为500万，已经成为危害极其严重的公共健康问题，其中大部分无法被完全治愈，引起社会广泛关注[2]。据家系调查及孪生子研究，孤独症病因遗传因素占90%，环境因素占10%[3]。目前国际上对于孤独症的遗传学研究虽然已经取得了很大进展，鉴定了超过100多个易感基因，但由于孤独症高度的表型和遗传异质性，这些位点或基因很少能够被重复验证，所有已发现的遗传变异还只能解释大约10%～20%的ASD患者，总体而言，关于孤独症的分子致病机制研究还处于早期阶段，而且多数研究以ASD（Autism spectrum disorder，孤独症谱系障碍）而不是典型的孤独症患者为研究对象，进一步导致了研究样本的不同质性。基于此，对于孤独症进行临床分型研究是很有必要的一件事情。高功能孤独症是孤独症中总智商（full intelligence quotient， FIQ）≥70的一类特殊人群，占整个孤独症的30%左右[4]，选取高功能孤独症儿童进行研究可以最大限度减少智力相关因素的影响。FOXP2基因位于染色体7q31，与人的语言表达能力相关[5]。最近一项研究探讨发现了转录因子FOXP2与CNTNAP2基因的表达调控相关，FOXP2转录因子可以结合到CNTNAP2基因内含子1的调控序列上来直接调控CNTNAP2基因的表达，使得CNTNAP2基因表达量大量下调，进而引发孤独症[6]。该文方便选取2016年1月—2017年1月在该院儿童保健科确诊的100例高功能孤独症儿童（病例组）及同期在儿童保健科体检中心体检的120名身体及精神均健康儿童（对照组），首次对FOXP2基因及高功能孤独症的关系进行了病例对照研究，为孤独症临床分型研究提供参考，现报道如下。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料

病例组高功能孤独症儿童样本方便选取于该院儿童保健科，并由1 名获得儿童精神卫生专业资格证的主任医师，按DSM-IV 标准以及国际疾病分类第十版与孤独症相关的诊断标准进行诊断，且其FIQ≥70， 共100例，其中男82例，女18例，平均年龄（7.29±1.92）岁，患者均为汉族儿童，与孤独症类似的脆性X 染色体综合征、Asperger综合征、不典型孤独症等疾病均被排除，患儿民族均为汉族。对照组样本共120名，其中男94名，女26名，平均年龄（8.17±2.23）岁，均为汉族儿童，采集于该院儿童保健科体检中心，均为身体及精神健康儿童。该研究均征得所有被研究儿童监护人的知情同意，并且与被研究儿童监护人签署知情同意书。两组儿童在年龄、疾病组成方面比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取被试儿童2 mL静脉血，EDTA抗凝，采用QIAGEN公司的人全血DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取DNA，-80℃保存待测。

1.2.2 基因芯片 随机选取其中1例高孤独症儿童的DNA送“北京贝康医学检验所”进行基因芯片分析。

1.2.3 生物信息学 采用SNPbrowser程序和NCBI中SNP数据库选择FOXP2基因的2个SNP位点rs121908377、rs121908378，并采用聚合酶链反应和基因测序的方法对各位点进行基因分型。

1.2.4 PCR及测序（分型检测） 采用聚合酶链反应扩增FOXP2基因的rs121908377、rs121908378位点序列，使用的引物见表1，PCR产物纯化后送英骏公司测序。PCR条件：采用表一所列的正向及反向引物、50μL反应体系以及下列所述条件对两段目的片段进行扩增。50 μL反应体系中含25 μL酶混合液（1.25 U Takara Taq DNA聚合酶，0.4 mM dNTP，3 mM Mg2+），0.5 μmol/L的引物和100 ng基因組DNA，补加纯水至50 μL。rs121908377和rs121908378的PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共32个循坏，产物纯化后-20℃保存。

1.3 统计方法

采用haploview 4.1分析软件对FOXP2基因的rs121908377、rs121908378两个SNPs位点的基因分型数据进行χ2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因芯片

基因芯片结果为阴性，没有发现任何SNPs位点及CNV（copy number varients，拷贝数变异）。

2.2 哈德温伯格遗传平衡检验

对高功能孤独症病例组和对照组的FOXP2基因的2个病源相关的SNP位点rs121908377、rs121908378的基因分型结果运用haploview 4.1软件进行哈德温伯格遗传平衡检验，病例组FOXP2基因的2个SNPs 的基因型频率为0.960、0.970，对照组的2个SNPs基因频率为0.958、0.958，哈德温伯格值均为1.0，显示这两个位点的基因型频率分布遵守哈德温伯格平衡（P>0.05）。

2.3 FOXP2基因的连锁不平衡检验

基因FOXP2的2个SNPs配对的D'和r2值见下表2。在病例及对照中，rs121908377和rs121908378两个位点之间的连锁不平衡程度都很低，这与两个位点在染色体上相距较远相关。

2.4 FOXP2基因2个SNPs 的关联分析

高功能孤独症儿童的病例及对照关联分析结果显示两个SNPs位点等位基因在病例及对照间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3 讨论

高功能孤独症是孤独症中的一种临床分型，高功能孤独症儿童智力水平低于正常儿童，往往伴随有特殊功能，存在语言感知功能障碍[7]。基因芯片是研究儿童自闭症最常见的方法[8]，该研究首先是运用基因芯片的方法对随机选取的1例高功能孤独症儿童进行基因分析，结果显示没有发现SNPs位点及CNVs，进一步说明了孤独症的高度异质性。

基因FOXP2可能在语言发育障碍或孤独症发病机制中发挥某种主要作用[9-10]，其作用机制与调控相关[11]。基于此，该文进行了FOXP2基因和高功能孤独症的病例对照研究。该研究结果显示FOXP2基因的rs121908377、 rs121908378两个 SNPs 位点的等位基因频率在高功能孤独症儿童病例及对照间差异无统计学意义（P>0.05），当前的研究结果并不支持FOXP2基因与高功能孤独症的致病相关。虽然该研究结果如此，但是这不能成为FOXP2基因与高功能孤独症无关的证据，也有可能是因为该研究中收集的病例及对照数量不够多，无法检测到微效基因效应。事实上，导致多基因疾病的原因较多，对其进行关联研究普遍存在重复性差的问题。

综上所述，该文的病例对照研究结果不支持FOXP2基因与高功能孤独症的致病相关。尽管该研究结果不支持FOXP2基因与高功能孤独症的致病相关，但由于该研究所收集的样本量有局限性，而且只基于病例对照法进行研究，因此更大样本量、更多位点以及基于家系研究方法进行重复验证是有必要的。

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（收稿日期：2017-07-15）endprint