外周淋巴细胞冻存技术在复发性流产主动免疫治疗中的应用研究

刘佳+傅强+袁媛+宋影莹+侯莉莉

【摘要】 目的：探討外周淋巴细胞冻存技术用于复发性流产（RSA）主动免疫治疗的临床效果。方法：对2014年11月-2016年1月经本院中医科门诊确诊的77例RSA患者的临床资料进行回顾性分析，所有浓缩白细胞通过无偿献血方式获得，进一步采用Ficoll密度梯度离心法分离淋巴细胞，淋巴细胞经自体血浆冻存，深低温保存，分次复苏后用于RSA患者主动免疫治疗。通过台盼蓝拒染实验和流式细胞技术比较冻存不同时期淋巴细胞存活率和CD3+T、CD3+CD8+T和CD3+CD4+T细胞免疫表型变化，评价冻存淋巴细胞的活性和稳定性；通过比较治疗前后RSA患者HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性封闭抗体转阳率和再次妊娠成功率，评价冻存外周淋巴细胞用于RSA治疗的效果。结果：与新鲜分离的淋巴细胞比较，存活7、15、30、60、90 d的淋巴细胞存活率和细胞表型稳定性比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；经冻存淋巴细胞主动免疫治疗后，封闭抗体累计转阳率为93.5%。封闭抗体阳性者再次妊娠成功率为90.3%，显著高于阴性者的20.0%，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：外周血淋巴细胞经自体血浆冻存，深低温保存后，不影响细胞存活率和稳定性，且对RSA患者治疗效果明确。此外，此法获得的淋巴细胞来源安全、可靠，患者依从性高，且可一定程度缓解临床血液制品来源困难的处境，具有进一步临床推广使用的价值。

【关键词】 外周淋巴细胞； 冷冻保存； 复发性流产； 主动免疫治疗

【Abstract】 Objective：To explore the clinical efficacy of peripheral lymphocyte cryopreservation technique for lymphocyte active immunotherapy（LIT） in the treatment of recurrent spontaneous abortion（RSA）.Method：The clinical data of 77 patients with RSA who had been diagnosed with traditional Chinese medicine from November 2014 to January 2016 were retrospectively analyzed.All the concentrated white blood cells were obtained by means of blood donation，further using ficoll density gradient centrifugation to separate lymphocytes.Trypan blue exclusion and flow cytometry assay were used to detect the cell viability and the changes of CD3+T，CD3+CD8+T and CD3+CD4+T lymphocytes at different time points respectively.The positive rates of HLA-Ⅰ，Ⅱ specific blocking antibodies and the outcome of re-pregnancy were adopted to evaluate the efficacy of cryopreserved lymphocyte active immunotherapy in treatment of RSA.Result：There were no significant differences in lymphocyte survival rate and and cell phenotype stability between fresh day and 7，15，30，60，90 days compared with isolated lymphocytes（P>0.05）.Furthermore，after treatment，the positive rate of blocking antibodies was up to 93.5%.In addition，the probability of successful pregnancy rate was 90.3% in patients with positive blocking antibodies，which was significantly higher than 20.0% in negative patients，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The survival rate and stability of the cells are not changed after autologous plasma cryopreservation，and the method is effect for the treatment of RSA.The lymphocyte derived from voluntary blood donation is safe and reliable，and the patients compliance is good.To some extent，this approach has eased the plight of the source of blood products，and with further clinical use of the value.

【Key words】 Peripheral lymphocytes； Cryopreservation； Recurrent spontaneous abortion； Allogenic immunotherapyendprint

First-authors address：Obstetrics and Gynecology Hospital Affiliated to Nanjing Medicine University，Nanjing 210004，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.33.006

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）指与同一配偶发生连续3次或3次以上的自然流产[1]。RSA病因复杂，主要包括遗传因素、子宫解剖异常、感染因素、内分泌异常、血栓前状态、免疫紊乱等，其中50%～60%与免疫紊乱有关[2]。免疫性流产分为自身免疫型和同种免疫型。研究发现，同种免疫型流产的发生与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）免疫应答有关[3]，临床表现为RSA患者体内封闭抗体（blocing antibodies，BA）不足，即抗丈夫淋巴细胞抗体（antipaternal lymphocyte antibody，APLA）阳性率低[4]，超微结构显示滋养细胞浅着床、血管重铸障碍、滋养细胞的合体形成不足以及在种植部位有针对滋养细胞的免疫攻击现象[5]。

目前，淋巴细胞主动免疫治疗（lymphocyte active immunotherapy，LIT）是针对以封闭抗体缺乏为主要临床特征的母胎免疫识别低下型RSA的重要手段[6-7]。许多研究证实，LIT可显著提高RSA患者再次妊娠成功率，并且母儿安全性良好[8-9]。然而，目前淋巴细胞主动免疫疗法淋巴细胞的制备一般采用反复多次抽取供血方的外周血，分离获得淋巴细胞的方法[10-11]。此法需供血方多次到院抽血，因此依从性差，血液制品的安全性也不能保障。另外，抽取的供血方的外周血，除用于淋巴细胞提取外，其他血液成分，如红细胞、血浆、血小板等均得不到充分利用。为此，本单位与南京红十字血液中心合作，供血方以无偿献血的方式一次性献全血400 mL，仅经成分分离后的白膜用于淋巴细胞提取，其他血液成分可同时用于临床。获得的淋巴细胞经自体血浆冻存，深低温保存，分次复苏后供RSA患者免疫治疗。本研究通过比较不同时期冻存淋巴细胞的存活率和细胞表型的变化，评价冻存淋巴细胞活性的稳定性，通过比较治疗前后封闭抗体转阳率和再次妊娠成功率，评价冻存淋巴细胞用于RSA治疗的效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2014年11月-2016年1月本院中医科门诊确诊的77例RSA患者的临床资料，所有研究对象夫妇双方染色体核型正常，内分泌检查无异常，血常规、肝肾功能及凝血功能检测正常，排除感染性疾病、遗传疾病和生殖解剖结构异常，抗心磷脂抗体、抗子宫内膜抗体筛查阴性，HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗体检测阴性。77例RSA患者，年龄22～47岁，平均（29.8±4.6）岁，流产次数2～6次，平均（3.5±0.8）次。所有研究对象签署知情同意书，并经院医学伦理委员会通过，自愿接受淋巴细胞主动免疫治疗。

1.2 试剂与仪器 （1）主要试剂。封闭抗体检测试剂盒：HLA特异性抗体检测试剂盒（美国莱姆德公司），淋巴细胞分离液（Axis-Shield），细胞冷冻保护剂（Bioniche Pharme Group Limited），巴士吸管（Biologix），冷冻管（Corning）。（2）仪器：冷冻离心机（Eppendorf），超低温冰箱（海尔），超净工作台（苏州净化），流式细胞仪（BD），气态液氮生物容器（金凤）。

1.3 方法

1.3.1 淋巴细胞制备 患者丈夫或无关第三方以无偿献血的方式一次性献全血400 mL，全血经成分分离后的白膜经Ficoll密度梯度离心获得淋巴细胞，淋巴细胞经90%自体血浆+10%细胞冷冻保护剂重悬，调节细胞浓度至（2～4）×107个/mL，程序降温冻存后置于液氮中保存，复苏后使用。

1.3.2 不同时期冻存淋巴细胞活性测定 取新鲜分离及冻存后7、15、30、60、90 d淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10 μL，加入血细胞计数板，显微镜下观察，随机计数200个细胞，计算活细胞百分率。活细胞百分率=（活细胞数/总细胞数）×100%

1.3.3 不同时期冻存淋巴细胞稳定性测定 分别在淋巴细胞冻存前，冻存后7、15、30、60、90 d流式细胞仪检测CD3+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞和CD3+CD4+T淋巴细胞百分比，比较不同时期冻存淋巴细胞活性的稳定性。

1.3.4 免疫方法 复苏后的淋巴细胞给予患者前臂内侧多点皮下注射。4次为一疗程，每次间隔2周，1个疗程后复查封閉抗体。若转阳，可考虑妊娠，孕后加强注射3～4次，每次间隔3～4周，直至孕12周。若转阳后，仍未能妊娠，每隔6～8周加强注射1次。若未转阳，继续一疗程免疫治疗后考虑妊娠。

1.3.5 封闭抗体检测 ELISA法检测患者外周血HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗体滴度，具体操作按照HLA特异性抗体检测试剂盒说明书进行。

1.4 观察指标

1.4.1 封闭抗体转阳率比较 第一疗程最后一次淋巴细胞主动免疫治疗结束后一周，抽取患者外周血，用封闭抗体EILSA检测试剂盒测定HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗体，计算淋巴细胞主动免疫治疗后第一疗程封闭抗体转阳率。第一疗程未转阳患者，继续予以第二疗程淋巴细胞主动免疫治疗，并于第二疗程最后一次治疗结束后一周抽取外周血，测定HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗体，计算第二疗程封闭抗体转阳率和累计转阳率。

1.4.2 再次妊娠成功率比较 将妊娠≥14周且B超检查未见异常视为妊娠成功。计算各组再次妊娠成功率，以其作为疗效评价标准。随访RSA患者再次妊娠、胎儿发育以及流产情况。endprint

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0軟件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用方差分析；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时期自体血浆冻存淋巴细胞存活率比较 淋巴细胞经自体血浆冻存，气态液氮保存，在冻存7、15、30、60、90 d后复苏，台盼蓝拒染实验观察活细胞均形态完整，细胞存活率分别为（86.67±0.21）%、（86.89±0.54）%、（85.58±0.59）%、（84.98±0.41）%、（85.03±0.33）%，不同时期冻存淋巴细胞与新鲜分离淋巴细胞存活率（87.31±0.48）%比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.2 不同时期冻存淋巴细胞免疫表型变化比较 自体血浆冻存，气态液氮低温保存的淋巴细胞，在0～90 d内CD3+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞和CD3+CD4+T淋巴细胞百分比虽逐渐下降，但与冻存前比较差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3 冻存淋巴细胞主动免疫治疗后封闭抗体转阳率比较 77例接受冻存淋巴细胞主动免疫治疗的RSA患者，第一疗程结束后55例HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗体转阳，第一疗程转阳率为71.4%；第二疗程结束后17例HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗体转阳，第二疗程转阳率为77.3%，累计转阳率为93.5%，见表2。

2.4 冻存淋巴细胞主动免疫治疗后封闭抗体阳性与阴性者再次妊娠成功率比较 77例接受冻存淋巴细胞主动免疫治疗的RSA患者再次妊娠后66例妊娠>14周，11例患者再次妊娠丢失，再次妊娠成功率为85.7%。其中封闭抗体阳性者再次妊娠成功率为90.3%，阴性者为20.0%，封闭抗体阳性者再次妊娠成功率显著高于阴性者，比较差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

3 讨论

研究表明，孕妇血中的APLA可中和同种异体抗原，而不使胎儿受到排斥，还可直接结合到靶细胞的抗原上，降低它们对受体细胞参与免疫反应的敏感性[12-14]。APLA产生不足，母体对胎儿产生强烈的排斥现象，发生于孕早期可出现反复自然流产，孕晚期则可发生妊娠期高血压疾病、胎儿宫内生长受限，甚至胎死宫内[15-16]。

目前，针对APLA缺乏复型RSA仍主要采用丈夫或无关第三方的外周血淋巴细胞主动免疫疗法[17]。循证医学研究表明，经淋巴细胞主动免疫治疗后，APLA阳性率明显高于治疗前，再次妊娠成功率达72.73%～86.20%，其中APLA阳性者再次妊娠的成功率明显高于阴性者，且未发现对母、儿的副反应[18-20]。

本研究结果表明，经自体血浆冻存的淋巴细胞在冻存3个月时存活率仍达85%左右，与新鲜分离淋巴细胞存活率比较，差异无统计学意义（P>0.05），并且细胞免疫表型稳定。回顾性分析2014年11月-2016年1月完成1～2疗程淋巴细胞主动免疫治疗的77例RSA再次妊娠患者的临床资料，结果显示：经自体血浆冻存淋巴细胞免疫治疗后，HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ类特异性抗体累计转阳率，即封闭抗体累计转阳率为93.5%，再次妊娠成功率（以妊娠>14周计算）为85.7%。

综上所述，与传统淋巴细胞制备方法比较，本法获得的淋巴细胞来源于血站，严格按照血液制品使用规范采集，安全性高，供血方无需多次抽血，依从性好。并且，供血方所献全血的其他成分也能得到充分利用。另本法获得的淋巴细胞经自体血浆冻存后不影响细胞存活率和封闭抗体的转阳率，对RSA患者淋巴细胞主动免疫治疗效果明确，且可一定程度缓解临床血液制品来源困难的处境，具有进一步临床推广使用的价值。

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（收稿日期：2017-08-04） （本文编辑：程旭然）endprint