益脾养肝方对肝癌前病变大鼠血清IL-6、TNF-α的影响

李京涛，魏海梁，闫曙光，郭 辉，鞠 迪，史晓燕，常占杰

(1. 陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000；2. 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000)

肝癌是临床常见消化道恶性肿瘤，其具有发病隐匿、发展迅速、病死率高等特点，临床上以手术治疗为主、放化疗结合为辅的综合治疗虽然有一定疗效，但仍然存在预后差、复发率高等缺点。肝癌前病变是指从肝硬化发展成为肝癌的中间阶段，肝细胞的重度非典型腺瘤样增生和变异肝细胞结节与肝癌的发生关系最为密切，若能提前干预肝癌前病变的发展，将可逆转肝癌的发生[1-2]。前期研究显示，益脾养肝方可能具有预防肝癌前病变的作用[3-4]，但其机制不明。本实验观察了益脾养肝方对二乙基亚硝胺(DENA)诱导的肝癌前病变大鼠肝功能、血清炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及组织病理学的影响，旨在探讨该方的作用机制，为其临床应用提供依据。

1 实验资料

1.1实验动物 选取SPF级Wistar雄性大鼠80只，体质量180～220 g，均购于第四军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK(军)-2012-0007，饲料购于西安交通大学实验动物中心，饲养在陕西中医药大学实验中心。

1.2实验试剂和药品 DENA(0.95 g/mL，美国Sigma公司)；IL-6和TNF-α试剂盒(南京森贝伽生物有限公司)；益脾养肝方：由白术、党参、熟地、鳖甲、枸杞、半枝莲、郁金、姜黄、白花蛇舌草组成，药材均统一由陕西中医药大学药剂科购买并制备成冻干粉，每克冻干粉的生药含量为5 g,4 ℃冰箱密封保存，需要时以100 ℃沸水溶解，配制成大剂量浓度为1.0 g/mL、小剂量浓度为0.5 g/mL的中药药液。

1.3动物分组、造模及干预 将80只喂养1周的 Wistar雄性大鼠随机分为空白组、模型组、益脾养肝方小剂量组、益脾养肝方大剂量组，每组20只。除空白组外，其余组均给予DENA(0.5 mL/100 g)腹腔注射，2次/周(即1次/84 h)， 50 mg/(kg·周)，连续给药至16周；在此过程中，益脾养肝方小、大剂量组分别给予0.5 g/mL和1.0 g/mL益脾养肝方灌胃，空白组、模型组给予生理盐水灌胃，均10 mL/kg，1次/d，第16周灌胃24 h后处死大鼠。

1.4取材及指标测定 处死大鼠前称体质量。采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，心脏采血注入2支EDTA管中，将血标本分为2份，一份送陕西中医药大学附属医院生化检验科检测肝功能指标(ALT、AST、GGT)，另一份离心后提取血清用于检测IL-6、TNF-α水平(按照ELISA试剂盒说明操作)；再解剖腹腔，完整取出肝脏，分别于肝左叶、右叶、尾叶取材并置于4%甲醛溶液中固定,常规HE染色，光镜观察。

1.5统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件处理实验数据，以方差分析进行组间比较，方差齐者采用单因素方差分析中的LSD进行检验，方差不齐者采用Tamhane's T2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠血清ALT、AST、GGT水平比较 模型组ALT、AST、GGT水平均明显高于空白组(P均<0.05)；益脾养肝方小剂量组和益脾养肝方大剂量组ALT、AST、GGT水平均明显低于模型组(P均<0.05)，且益脾养肝方大剂量组ALT、AST、GGT水平均明显低于小剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清ALT、AST、GGT水平比较

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与益脾养肝方小剂量组比较，P<0.05。

2.2各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较 模型组血清IL-6和TNF-α水平均明显高于空白组(P均<0.05)；益脾养肝方小剂量组和益脾养肝方大剂量组血清IL-6和TNF-α水平均明显低于模型组(P均<0.05)，且益脾养肝方大剂量组血清IL-6和TNF-α水平均明显低于小剂量组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与益脾养肝方小剂量组比较，P<0.05。

2.3各组大鼠肝脏组织病理表现 空白组大鼠肝脏实质细胞排列比较整齐，围绕着中央静脉形成“辐辏”样分布，肝实质细胞胞浆均匀红染，胞核居于中央，核膜完整，肝小叶内未见明显异常成分存在，汇管区动静脉、小胆管结构清晰，未见内皮细胞水肿和炎症细胞向肝脏实质内浸润。模型组大鼠肝实质细胞水肿变形，胞内脂肪沉积，局部肝实质细胞坏死，汇管区胆管扩张，胆汁淤积，同时毛细胆管大量增生；肝实质细胞核体积肿大，伴见细胞核分裂呈多形性，同时伴有异型增生和结节形成，排列紊乱，增生胶原纤维条索破坏形成假小叶，淋巴细胞向肝窦内和汇管区移行。益脾养肝方小剂量组和大剂量组肝细胞异型增生和核分裂相均较模型组减少，肝实质细胞很少发生变性和坏死，淋巴细胞向汇管区和肝窦内的浸润显著减少。见图1～4。

图1 空白组大鼠肝脏组织HE染色表现(×100)

图2 模型组大鼠肝脏组织HE染色表现(×100)

图3 益脾养肝方小剂量组大鼠肝脏组织HE染色表现(×100)

图4 益脾养肝方大剂量组大鼠肝脏组织HE染色表现(×100)

3 讨 论

肝炎到肝癌的形成过程比较漫长，而肝癌前病变是从肝硬化发展为肝癌之间一个不可逾越的过程，如果能够提前阻止肝癌前病变的形成过程，可延缓或阻断病情发展，显著降低肝癌的发生率。祖国传统医学中对肝癌前病变虽没有明确的概念，但中医自古有“既病防变”的理念。益脾养肝方是我院沿用多年的中药复方，方中熟地黄补肾滋阴，枸杞益阴养肝；白术健脾益气；党参补中益气生血，助运脾胃，达到后天得养、血气得充之目的；郁金行气化瘀，气行则血行；姜黄合鳖甲散瘀行气，消积散结；白花蛇舌草合半枝莲消痈散结，清解热毒。全方具有养肝健脾、活血行气、解毒消炎之功。现代药理学研究表明，白术挥发油可提升小肠推进率，降低胃内残留率，进而发挥促进胃肠蠕动的功效[5]；而白术内酯I可抑制黑色素瘤A875活性，可调整细胞周期，促进细胞凋亡，减少肿瘤微血管的形成，起到抗肿瘤作用[6]。鳖甲活性多肽可抑制小鼠肝纤维化模型中肝功指标、纤维化指标的升高,促进超氧化物歧化酶(SOD)、金属基质蛋白酶-1(MMP-1)的合成，进而起到保护肝细胞、逆转肝纤维化的作用[7]；半枝莲可通过降低实验性肝癌组织中ADAM10阳性表达率来抑制原发性肝癌形成[8]，而半枝莲醇提取物可通过阻止NF-κB诱导的炎症相关因子IL-6、IFN-γ等的释放，促进肝脏谷胱甘肽的表达而发挥保肝作用[9]。白花蛇舌草挥发油可抑制HeGP2细胞活力，使细胞体积变小、变圆、核固缩、细胞内空泡变多等，抑制细胞生长[10]。白花蛇舌草总黄酮可抑制胃癌BGC-823细胞株DNA复制，阻滞细胞增殖周期，促进细胞凋亡；同时其可抑制CLIC4蛋白的表达和TGF-β1介导肿瘤相关成纤维细胞的转化，从而抑制肿瘤侵袭、转移[11]。本研究结果显示，模型组ALT、AST、GGT水平均明显高于空白组；益脾养肝方小剂量组和大剂量组ALT、AST、GGT水平均明显低于模型组，且益脾养肝方大剂量组各指标水平均明显低于小剂量组；益脾养肝方小剂量组和大剂量组大鼠肝脏病变明显轻于模型组。提示益脾养肝方可改善肝功能，抑制肝癌前病变的进展。

肝癌前病变的形成过程与炎症反应密切相关，炎症性微环境在介导整个肝癌的形成过程中发挥着“推动力”的作用，炎症因子则是推动肝脏炎症反应的有力“执行者”。TNF-α作为促炎因子，可通过介导NF-κB途径激活肝星状细胞，同时NF-κB的活化可促进IL-1、IL-6、IL-8、TGF-β等的表达，起到放大炎症反应的作用[12-13]。IL-6可促进B细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞活化，使Kupffer细胞受损和触发炎症反应[14]；且IL-6与IL-6Ra结合使PI3K活化，PIP2被磷酸化为PIP3，其通过间接或直接途径激活Akt，进而促进肝癌进展[15-16]。本研究结果显示，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6水平明显增高，益脾养肝方小剂量组和大剂量组血清IL-6和TNF-α水平均大幅降低，且大剂量组明显低于小剂量组。提示益脾养肝方可抑制肝脏炎症反应。

综上所述，益脾养肝方可抑制肝癌前病变的进展，其可能是通过降低炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平，继而发挥抑制肝脏炎症反应，降低炎性微环境对肝实质细胞的持续刺激作用来实现的。本实验为益脾养肝方在临床推广应用提供了一定的理论基础。

[1] 闫亚南,王宁,王卓昱,等. 直接灸“肝俞”对原发性肝癌癌前病变大鼠T淋巴细胞亚群的影响[J]. 针刺研究,2016,41(4):321-326

[2] 宋艺君,杨史军,王湘,等. 丹皮酚对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌前病变的预防作用[J]. 陕西中医,2015，36(9):1270-1271

[3] 南然,宋春荣. 常占杰教授用益脾养肝法治肝病经验谈[J]. 光明中医,2012,27(12):2408-2409

[4] 李京涛,郭师,席奇,等. 益脾养肝方联合肝动脉化疗栓塞术治疗原发性肝癌的疗效观察[J]. 陕西中医,2015，36(8):944-945

[5] 陈镇,夏泉,黄赵刚,等. 白术挥发油对小鼠胃肠功能的影响[J]. 中国实验方剂学杂志,2009,15(8):66-68

[6] 潘利文,宋捷. 白术内酯Ⅰ体内外的抗黑色素瘤研究[J]. 中国医院药学杂志,2015,35(8):682-685

[7] 孔菲菲. 鳖甲活性多肽的制备工艺及其抗肝纤维化的药效学研究[D]. 武汉：湖北中医药大学,2014

[8] 康志强,李平,段刚峰. 半枝莲对大鼠原发性肝癌组织中ADAM10表达的影响[J]. 肿瘤,2013,33(10):879-883

[9] 牛成伟,季莉莉,王峥涛. 半枝莲对黄药子肝毒性的保护作用及其机制[J]. 药学学报,2016，51(3):373-379

[10] 王丽丽,林婧,蔡巧燕,等. 白花蛇舌草挥发油对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用[J]. 福建中医药,2013,44(3):60-61

[11] 王秋兰,薛永杰,韩涛. 胃癌中CLIC4蛋白表达及白花蛇舌草总黄酮对其表达的影响[J]. 临床与实验病理学杂志,2016,32(6):681-684

[12] 贾玉杰,赵芳,张彩华,等. 中药肝复康对TNF-α介导的炎症性肝损伤和大鼠肝纤维化的抑制作用[J]. 中国微生态学杂志,2016,28(2):146-150

[13] 刘萍. TNF-α在肝衰竭疾病中作用的研究进展[J]. 湖南中医杂志,2016,32(9):188-190

[14] 周毕军,赵岩,黄川锋. 鬼针草水提物对脂多糖诱导肝损伤小鼠肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的影响[J]. 中国老年学杂志,2016,36(12):2858-2859

[15] Rose-John S. IL-6 trans-signaling via the soluble IL-6 receptor:importance for the pro-inflammatory activities of IL-6 [J]. Int J Biol Sci,2012,8(9):1237-1247

[16] Hammerich L,Tacke F. Interleukins in chronic liver disease: lessons learned from experimental mouse models[J]. Clin Exp Gastroenterol,2014,7:297-306