原位自组装多肽在肿瘤和细菌感染诊断及治疗中的研究进展

张从柔，黄帆，刘鉴峰，杨丽军

自组装是自然界中一种普遍存在的现象，是指结构单元通过非共价键（如氢键、疏水作用、范德华力等）自发形成具有一定稳定几何外形的结构，生物体内双螺旋DNA的形成及某些功能性蛋白质的产生均属于自组装现象［1-3］。研究人员模拟天然自组装的过程开发了一系列自组装材料，在催化材料、生物医药、膜分离技术及电池制造等领域得到了广泛应用，尤其是在生物医药行业，小分子自组装材料备受青睐［4-6］。近年来，科学家提出了“原位自组装”的概念，即具有靶向性的小分子自组装前体（如多肽等）在体内特定靶点部位（如肿瘤、炎症部位等）高效聚集，并在该部位特异性高表达的物质（如酶、ATP等）诱导下，通过自组装形成纳米结构［7-8］。原位自组装多肽是一类可修饰性强且制备简单的小分子自组装材料，由于具有良好的生物相容性、高的体内稳定性、可降解性、生物膜穿透性及可高效负载探针和药物等优点，其在生物医药领域的应用前景广阔［9］。通过多肽原位自组装，可以准确地将诊断探针和治疗药物高效富集到病灶部位，从而实现对疾病的精准定位和靶向治疗。

肿瘤和细菌感染是严重危害人类健康的两大疾病。肿瘤细胞的转移性、异质性及肿瘤内环境的复杂多变性为肿瘤诊断和治疗带来了极大的困难［10］，而抗生素滥用导致的细菌耐药性不断增强对细菌感染的诊疗提出了更大的挑战［11］。最近，研究人员基于原位自组装多肽的生物学优点及其对疾病的精准靶向作用开发出一系列的新型多肽诊疗试剂。本文将着重介绍原位自组装多肽在肿瘤及细菌感染的诊断及治疗中的研究进展。

1 原位自组装多肽在肿瘤诊断及治疗中的研究

1.1 原位自组装多肽在肿瘤诊断中的研究 目前提高肿瘤治愈率的最有效手段是早发现、早治疗。因此，发展能够对肿瘤进行早期、快速检测并准确定位的诊断方法能够大大降低肿瘤的死亡率。相对于正常细胞，肿瘤细胞处于快速增殖的状态，因此某些酶在肿瘤细胞中高表达，如碱性磷酸酶（ALP）［12］。根据肿瘤细胞的这一特点，可设计制备基于酶诱导的原位自组装多肽分子探针，用于肿瘤早期诊断。Zhou等［13］将对ALP敏感的多肽链与荧光分子4-硝基苯基-2-氧杂-1，3-二唑（NBD）共价结合，构建了一种高敏感度的自组装多肽荧光探针pNDP1。当该探针到达肿瘤部位时，高表达的ALP切掉磷酸基团生成NDP1，发生原位自组装，形成纳米纤维。该研究发现，在0～24 h内，随着时间的增加，肿瘤部位的荧光不断增强，说明NDP1纳米探针在肿瘤部位持续靶向聚集。这种具有ALP响应性的原位自组装多肽荧光探针为肿瘤早期精确诊断提供了新方法，值得深入研究。

最近光声成像因可无创、实时地监测患者病灶而受到人们的广泛重视［14-17］。基于此成像技术，Dragulescu-Andrasi等［18］制备了一种对肿瘤细胞内高表达的弗林蛋白酶敏感的多肽序列（RVRRCK），并在此序列的K端连接2-氨基-6-氰基苯并噻唑和荧光染料Atto 740，构建出一种高效的光声成像探针。在弗林蛋白酶催化下，RVRR序列分离，半胱氨酸上的胺基和巯基与2-氨基-6-氰基苯并噻唑上的氰基发生“click”反应，聚集并自组装于肿瘤细胞，发射出较强的光声信号，从而精确地检测出深层肿瘤，为肿瘤的临床诊断提供了新思路。

1.2 原位自组装多肽在肿瘤治疗中的研究 肿瘤治疗一直以来都是人们需要攻克的难题，而近年来肿瘤耐药性的出现使肿瘤治疗更加困难［19］。原位自组装多肽能够靶向性地在肿瘤部位形成特殊的纳米结构，该纳米材料可以与细胞的一些支架蛋白如微管蛋白等结合，从而影响肿瘤细胞的迁移，起到杀伤肿瘤细胞的作用［20-21］。有研究基于肿瘤组织含有高浓度ALP的特点，研制出一种可被ALP诱导组装的四肽，这种多肽能够在肿瘤部位蓄积并自组装形成纳米结构，实现对肿瘤的靶向治疗［22-24］。在ALP作用下多肽酪氨酸残基上的磷酸基团脱离，促使多肽分子在肿瘤部位快速形成纳米纤维，该纳米纤维可以与细胞的死亡受体相互作用，将肿瘤细胞的生存信号转化为死亡信号，从而取得良好的肿瘤杀伤效果。

三磷酸腺苷（ATP）是生物体内最直接的供能物质，其释放出能量之后会转化成二磷酸腺苷（ADP），细胞内ATP与ADP的平衡对于生命活动有着非常重要的意义［25］。核肽是一种可以与核酶共价结合的多肽，具有良好的生物相容性和稳定性，且易在水中自组装成纳米结构［26］。最近，Wang等［25］设计了一条D-构型的核肽，序列为DFDFDKDKDFDKDLDKDL。其中，序列DFDF可以增强核肽的自组装能力，序列DKDKDFDKDLDKDL能够与ATP上的磷酸基团相结合，而D-构型氨基酸可抵抗蛋白酶的水解作用，保证核肽序列在体内的稳定性。该核肽能够选择性地与细胞内的ATP结合，原位共组装成稳定的纳米纤维并沉淀，阻断了ATP到ADP的转化，从而阻碍或者降低外排泵在肿瘤细胞中的作用，减少肿瘤细胞对化疗药的外排，降低耐药性，增强药物的抗肿瘤效果。此外，基于肿瘤部位因代谢旺盛导致的局部温度高于正常组织的特点，王浩教授课题组设计了一种温敏型的聚合物-多肽偶联物，可以靶向乳腺癌细胞高表达的表皮生长因子2（HER2）受体，并在较高肿瘤温度的促进下自组装于细胞表面，抑制乳腺癌细胞的增殖［27］。

1.3 原位自组装多肽在肿瘤诊疗一体化中的研究 肿瘤的诊疗一体化是肿瘤诊断和治疗发展的新方向。原位自组装多肽可以将诊断探针和治疗药物共价结合到同一分子上，并在肿瘤部位通过自组装形成纳米结构聚集体，在肿瘤诊疗一体化方面呈现出巨大的应用前景。Huang等［28］将吲哚菁绿（ICG）分子与磷酸酶诱导组装的多肽混合注射到小鼠体内，到达肿瘤部位之后，多肽在磷酸酶的作用下切掉磷酸基团，并与ICG共组装原位形成纳米纤维；该材料能够明显增加ICG在肿瘤细胞内的含量并能延长ICG的半衰期，获得了良好的荧光-光声双模态成像效果，实现了肿瘤的精准诊断，同时利用ICG良好的光热性能还可以对肿瘤进行有效的光热治疗。

Zhan等［29］提出“串联自组装”的概念，设计的多肽NBD-GFFPY-ss-ERGD能够靶向肿瘤组织，并在肿瘤部位自组装形成纳米结构，用于肝癌的诊断和治疗；在肝癌细胞中，ALP高表达于细胞膜上，谷胱甘肽（GSH）则高表达于细胞内，当多肽到达肿瘤组织以后，首先在ALP诱导下于细胞表面组装成纳米粒，通过胞吞进入细胞后，在GSH作用下，二硫键被还原切断，纳米粒自组装形成纳米纤维，体外和体内实验表明该化合物能够被肝癌细胞大量摄入，说明该材料在肝癌的诊断和治疗中有良好的应用前景。

此外，Zhang等［30］采用酶敏感序列（PLGVRG）将肿瘤靶向序列（RGD）与紫红素-18连接，形成的偶联物可在肿瘤部位组装并发出光声信号，同时在激光照射时具有良好的光热效果，从而达到诊疗一体化的目的。Yang等［31］将双芘荧光探针（BP）、疏水性多肽序列（KLVFF）、pH敏感的聚组氨酸以及亲水性序列（PEG）共价连接成一化合物，该化合物可自组装形成纳米粒。该纳米粒在肿瘤微酸性环境诱导下发生电荷反转，改变形态形成纳米纤维，并富集ICG和阿霉素于肿瘤部位，从而实现光热-化学联合治疗，同时有较好的荧光成像效果。Han等［32］也制备了一类能在肿瘤微酸性环境下发生组装形态改变并可进行光动力治疗和肿瘤组织实时成像的原位自组装嵌合肽，获得了良好的肿瘤诊疗效果。

2 原位自组装多肽在细菌感染诊断及治疗中的研究

2.1 在细菌感染诊断中的研究 随着抗生素滥用现象增加，细菌耐药性问题日益突出，因此对于细菌感染在体内实时准确诊断的需求不断增长［5］。原位自组装多肽在细菌感染诊断方面展现出很大优势，有研究将靶向分子万古霉素、荧光分子罗丹明及放射性核素125I与可自组装的多肽分子FF共价结合，构建了一种荧光-同位素双模态分子探针，用于体内细菌感染诊断［33］。该探针中的万古霉素能够特异性识别革兰阳性菌细胞膜上的D-Ala-D-Ala结构，实现探针与细菌的靶向结合［34-35］。探针分子在细菌表面不断聚集，自组装形成稳定的纳米结构，吸附于细菌表面；罗丹明与125I可分别进行荧光和同位素成像，从而实现了对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌所致小鼠肌炎和肺炎的精确诊断［34-35］。

Li等［36］也针对细菌检测设计了一种新型光声成像探针。该探针以对炎症部位过表达的酶敏感的多肽序列（PLGVRG）为母体，将能靶向革兰阳性菌的万古霉素和可发射光声信号的焦脱镁叶绿素共价连接，取得了良好的光声成像效果。

2.2 原位自组装多肽在细菌感染诊疗一体化中的研究 原位自组装多肽可以靶向于细菌表面并聚集形成纳米结构，为体内细菌感染的诊断和治疗提供了新思路。Ren等［37］设计制备了含有万古霉素和NBD的细菌原位自组装多肽衍生物NBD-FFYEGK（Van），用于细菌感染的诊疗一体化研究。该分子中万古霉素能与D-Ala-D-Ala结构特异性结合，靶向于细菌表面，在细菌表面聚集组装成纳米粒。由于NBD在疏水环境中能发出较强的荧光［38］，因此细菌表面聚集态的NBD能发出强荧光信号，从而精准诊断细菌感染部位。对于革兰阳性菌枯草杆菌，该分子的最小抑菌浓度与游离的万古霉素大致相同；而对于对万古霉素有耐药作用的革兰阳性菌粪肠球菌，通过试验发现该分子的最小抑菌浓度明显低于游离的万古霉素。上述研究结果表明，该多肽衍生物对万古霉素耐药细菌具有很好的抑制效果。

3 小结

综上所述，原位自组装多肽因其特有的性质在肿瘤和细菌感染的诊断及治疗中呈现出具大的优势和潜能［39］。由于肿瘤及细菌感染部位特异性高表达的某些物质可以诱导这种多肽在病灶部位聚集并发生原位自组装，形成稳定的纳米结构，因此可以获得对疾病的精准诊疗并降低对正常组织毒副作用的效果。但是原位自组装多肽作为一种新兴研究领域，还有许多问题亟待解决，例如组装体在细胞内形态的表征、组装体与细胞的作用方式以及组装体调控细胞行为的机制等。因此，原位自组装多肽今后的发展可以从以下几个方面入手：设计具有新结构的多肽分子、开发新的体内响应组装方式、精准调控多肽的组装能力、实现多肽自组装的可逆化以及增加组装体在细胞或细胞器的浓度等。随着对原位自组装多肽研究的深入，其将会在疾病的诊断和治疗中发挥更突出的作用。