稻田生态系统氧化亚氮（N2O）排放微生物调控机制 研究进展及展望

秦红灵，陈安磊，盛荣，张文钊，邢肖毅，魏文学

（1.中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，湖南 长沙 410125；2.中国科学院桃源农业生态试验站，湖南 常德 415700）

N2O是全球第三大温室气体，其百年尺度单分子增温潜势（Global warming potential）约为CO2的298倍，对全球变暖的贡献约为6%[1]。除此之外，N2O会与平流层中的臭氧发生反应，导致臭氧层的破坏。因此，未来的气候变化和平流层中臭氧分配将在很大程度上取决于N2O排放和大气中N2O的浓度变化[2]。

水稻田是重要的农业土地利用方式，全球水稻种植面积超过1.35亿hm2[3]。我国是世界上水稻种植面积最大的国家之一，约2 900万hm2，分别占世界水稻种植面积的28%和全国耕地总面积的27%左右[4]。水稻生长期间，农户为提高产量往往采取淹水、落干、间歇灌溉等水分管理模式。频繁的水分变化，导致土壤氧气含量的频繁变化，好氧条件更有利于硝化微生物的生长，从而通过硝化作用产生大量NON，厌氧条件有利于反硝化微生物的生长，加之硝化作用提供的大量NON存在，反硝化作用可以释放大量的N2O，从而使稻田成为重要的N2O排放源。我国稻田N2O排放量占农田总排放量的11.4%[5]。因此，明确稻田生态系统N2O排放的微生物机制，对于减少稻田N2O排放与减缓全球变暖具有重要意义。

基于此，中国科学院亚热带农业生态研究所土壤微生物分子生态团队依托中国科学院桃源农业生态试验站，在过去10年（2009-2018年）重点围绕农田生态系统碳、氮、磷循环过程的微生物作用机理及调控技术开展研究，为提高农田土壤氮素的利用率，控制农区环境富营养化，减少地下水NO污染和减少稻田系统温室气体N2O排放量等提供了重要的理论依据和技术保障。为庆祝建所40周年，本文对近10年的工作进行梳理，针对稻田生态系统产生及消耗N2O关键过程的微生物调控机制进行综述，并在此基础上提出了下一步研究重点。

1 N2O产生和消耗过程

土壤中的N2O主要是通过一系列土壤微生物过程产生，而后在土壤剖面内迁移扩散，部分被截留在土壤水或土壤孔隙中，部分被土壤反硝化微生物利用进一步转化为分子氮（N2），剩余部分才能以N2O形式排出土壤。由此可见，土壤不仅具有产生N2O的能力，还具有吸收和消纳N2O的能力。土壤-大气界面监测到的N2O排放通量实质上是土壤中N2O产生、截留与消纳综合作用后的净排放量。但由于土壤产生N2O的速率往往高于其消纳速率，使得土壤成为N2O的排放源，因此，绝大多数研究仅关注了N2O净排放，而忽略了N2O消纳过程[6]。

1.1 土壤 N2O 产生过程

土壤N2O的产生主要是在一系列氮循环相关微生物的协同作用下进行的，包括硝化作用（Nitrification）、异养反硝化作用（Heterotrophic Denitrification）、自养反硝化作用（Autotrophic Denitrification）、硝酸盐异化还原作用（Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonia）、硝酸盐同化作用（Nitrate Assimilation）、 化 学 反 硝 化 作 用（Chemodenitrification）等[7]。但在自然和耕作土壤中，微生物硝化作用、反硝化作用被认为是土壤N2O的主要来源[8]，这两个过程对于全球N2O排放的贡献达到70%左右[9-10]。在土壤中硝化和反硝化过程基本是同时进行的，共同决定了土壤N2O的净排放[11]。

硝化作用是指土壤中微生物将铵盐氧化为硝酸盐的过程[12]，包含氨氧化过程和亚硝酸盐氧化两个过程。氨氧化过程由氨单加氧酶（AMO）催化完成，是硝化作用的限速步骤，主要由氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）完成[13]，中间过渡产物为羟胺（NH2OH），NH2OH可以在羟胺氧化还原酶（HAO）作用下发生不完全氧化，产生N2O，也可以先产生硝酰基（NOH），而后进一步通过化学歧化作用产生N2O[14]。另外，氨氧化过程的产物亚硝酸盐，也可以被自养氨氧化细菌进一步还原为NO、N2O，偶尔也可能被完全还原为N2，但N2O是最常见的终产物[15]。参与硝化作用的硝化菌是好氧菌，因此在通气状况良好时其活性较高，同时土壤pH、土壤氮素营养、有机碳和植物根系等环境因子也会影响土壤硝化作用[16]。反硝化作用是多种微生物参与的，硝酸盐在硝酸盐还原酶（Nar）、亚硝酸盐还原酶（Nir）、一氧化氮还原酶（Nor）以及氧化亚氮还原酶 （Nos）的作用下，最终被还原成氮气的过程。在这一过程中，N2O作为中间产物释放[17]。硝化作用的终产物硝酸盐是反硝化作用的反应底物，因此硝化-反硝化作用通常耦合发生，二者共同作用构成土壤氮肥损失的主要途径，可达氮肥投入量的40%[18]。同一土壤上硝化和反硝化往往同时发生，各个过程的难控制性，以及检测技术的精密性要求和方法的不成熟性，导致硝化与反硝化过程对氮素循环的相对贡献依然不明确。

1.2 土壤N2O消耗过程

土壤中N2O的消耗过程可分为非生物参与的N2O截留过程和微生物参与的N2O转化消纳过程。非生物截留过程主要是指土壤产生的N2O在土壤剖面内扩散传输，被土壤水溶解、土壤孔隙固持等作用，受到土壤结构、土壤水气状态等物理特性的影响。Clough等[19]综述了N2O气体在土壤中的各种去向，指出N2O在下层土壤主要是以扩散、对流形式运动，通过土壤剖面内N2O气体扩散系数可以准确估算最终N2O排放量，此外，被截留在土壤水气中的N2O也能通过土壤空气沸腾起泡或土壤径流损失。微生物转化过程主要是指含有氧化亚氮还原酶（NOS）基因的反硝化微生物将N2O还原为N2的过程。氧化亚氮还原酶（NOS）在反硝化过程中主导N2O的还原，因此以氧化亚氮还原酶基因（nosZ）为靶基因揭示微生物种群的N2O消耗还原能力是较直观的[20]。影响NOS酶活性的环境因素也会影响土壤还原N2O的能力，有研究表明氧化亚氮还原酶活性降低会引起N2O/N2比率的升高，这一比率也会随着NO3-增加而升高，因为NO3-比N2O更容易得到电子而阻碍N2O被还原[21]。而土壤水分状况也会影响N2O还原酶的合成，进而影响反硝化产物中N2O/N2比率[22]。尽管土壤由于其固有的机械组成和孔隙结构可在一定程度上截留一部分土体N2O，延长N2O在土体中的滞留时间而不轻易的扩散至大气中，但最终N2O的完全消耗只能通过微生物作用还原为N2。通常情况下异养细菌反硝化作用被认为是N2O消耗的主要原因[23]。N2O的非生物截留过程可以提高N2O在土壤中的留存时间，为N2O的生物消纳提供了更大的可能性。研究表明反硝化作用作为N2O源或汇的强度不仅取决于生物因素（反硝化酶活性、微生物群落等），还与N2O在土壤中的扩散作用和水中溶解度密切相关[6,24]。因此，N2O在稻田土壤中的非生物截留过程和微生物转化过程的协同研究对于土壤N2O总消纳能力的认识很有必要。

2 驱动稻田N2O排放关键过程的微生物作用机理

2.1 水稻土淹水-落干过程N2O释放的微生物驱动机制

水分是影响土壤N2O排放的关键因素之一[25]，稻田淹水和落干的转变会导致土壤水分条件的时空变化，从而影响土壤硝化和反硝化作用活性[26-27]，所以干湿交替过程会造成土壤N2O的大量排放。利用室内培养试验，探明了不同水分条件下反硝化基因的群落组成、数量与N2O释放过程的关系并比较了细菌和真菌对N2O排放的贡献。研究结果表明，水稻土含水量为80% WFPS时N2O释放量最大，含水量在60% WFPS时细菌比真菌对N2O排放的贡献要大。采用典型水稻土进行了淹水-落干和干湿交替过程的室内模拟试验，结果发现，淹水-落干过程中Eh的变化与N2O释放动态显著相关，从而明确了稻田水分变化过程中，氧化还原电位的改变是调控N2O排放的主导因子。淹水-落干过程中N2O的释放主要来自于细菌作用，真菌的贡献只占10%左右[27]。反硝化微生物的组成和数量对落干过程反应敏感且迅速，排水后24小时硝酸还原酶基因（narG）和氧化亚氮还原酶基因（nosZ）丰度和群落组成便发生明显变化，尤其是nosZ的响应更快，落干1 d即发生极显著的变化，随后不再发生显著改变[28]，而narG基因随落干的进行其组成和丰度由渐变到突变，但真菌amoA却无明显变化。统计结果显示，narG基因丰度和组成与土壤Eh和N2O排放速率间呈显著相关，而nosZ基因没有这种相关性，表明水稻土淹水-落干过程中含narG基因的微生物种群组成和数量是驱动N2O排放的关键反硝化微生物种群，而含nosZ基因的微生物种群与N2O排放动态并无直接关系[29]。在此基础上，进一步通过设计土壤培养试验，系统研究了典型水稻土淹水-落干过程中不同土层N2O产生、转化与释放的关键微生物驱动机制。结果表明，在水稻土落干过程中0～3 cm土层是N2O排放的主要来源，落干过程中的硝化微生物与反硝化微生物的协同作用是导致表土层产生和释放大量N2O的关键微生物驱动机制[30]。

2.2 水稻根际环境影响N2O释放的硝化及反硝化分子机理

根际是土壤中根系周围的狭小区域，距离根系表面1-3 mm，受植物根系与微生物活动的强烈影响[31]。根际环境中，植物、土壤和微生物之间通过物质和信息的交换形成复杂的交互作用关系，调控着农田生态系统土壤–作物系统中养分的转化和循环[32]。水稻生长季节，水稻植株通过根系分泌物和根系凋落物等向根际输入易于被土壤微生物利用的含碳有机物[33]。含碳有机物的分解不仅为反硝化微生物提供了有机底物，还可以提供电子，并且有机物质的分解作用需要消耗氧气，可以促进厌氧环境的形成，有利于反硝化作用[34]。另外，水稻根系还可以向根际分泌O2，进而促进氨氧化过程产生NO3-[35]，新产生的NO3-扩散到附近的厌氧区域被反硝化还原为N2O或N2[36]。由于水稻根际O2状况不同，硝化和反硝化作用在水稻根际的空间分布不同[37]。Arth 和 Frenzel[38]发现，硝化作用发生在水稻根表0-2 mm范围内，反硝化作用发生在水稻根表1.5-5.0 mm范围内。通过水稻根箱栽培试验结合田间试验研究了水稻根系生长影响N2O产生和释放的微生物机理，结果表明，在淹水-落干过程中水稻根系生长显著提高了根际区域N2O排放速率和土壤氨氧化细菌和含narG基因的硝酸还原菌的数量，并且二者之间具有显著的相关关系，说明硝化微生物和反硝化微生物的协同作用是导致水稻土壤落干过程中根际土壤N2O释放量增加的主要原因[39]。

2.3 施肥影响N2O释放的微生物驱动机制

施肥是农业生产中最重要的农艺措施之一，施肥除了提高土壤肥力，还会对其他土壤性质产生影响，例如施用铵态氮肥会降低土壤pH。随着中国农业集约化程度的不断提高，化肥用量大幅增加，特别是氮肥的用量。长期不均衡的施肥容易造成土壤退化、环境恶化等负效应。化肥和有机肥的合理施用是维持提高地力，培肥土壤，提高作物产量的重要途径。例如徐明岗等[40]研究发现，化肥和有机肥配施可以提高水稻产量，同时提高土壤有机质含量。然而，有研究发现，有机肥施用会通过改变土壤反硝化菌的群落结构，进而影响土壤N2O排放[41-42]。例如，Wolsing和Priemer 等[43]发现，有机肥相较于无有机肥处理，土壤中含nirK基因的反硝化细菌的群落结构存在显著差异。Enwall等[44]发现施用有机肥明显改变了含nosZ基因反硝化菌的群落结构，提高了土壤反硝化潜势。基于此，依托中国科学院桃源农业生态试验站水稻长期施肥定位试验，分别在水稻分蘖期（淹水）和成熟期（落干）系统监测了不同施肥处理的N2O排放动态，土壤氮素转化特征、反硝化潜势、反硝化微生物种群结构和丰度等。结果显示，与氮、磷、钾肥均衡施用相比，长期不施磷肥显著降低了亚硝酸还原酶基因（nirK）丰度和转录子丰度，抑制了部分含nirK基因种群反硝化菌的表达，而并未减少N2O还原酶基因（nosZ）丰度和表达丰度，从而降低了土壤反硝化潜势和N2O排放，而长期不施钾肥对N2O排放的影响较小。在氮、磷、钾肥均衡施用的基础上施加稻草，则会显著提高nirK和nosZ基因丰度和表达丰度，从而提高土壤反硝化潜势和N2O排放通量。相关性分析结果显示，土壤N2O排放速率与nirK/nosZ基因表达丰度比值显著相关（P ＜ 0.05），说明在评估有机肥施用对土壤N2O排放能力影响的时候，需同时考虑N2O的产生活性和转化消纳活性[45]。

2.4 水稻土N2O转化能力、反应底物浓度及关键功能微生物组成结构间的耦合机制

水稻田淹水期的存在是水稻田区别于旱作农田的最大特征，而许多研究报道表明淹水或厌氧的环境有利于土壤N2O的吸收。水稻田是一种长期处于淹水缺氧状态中的人工湿地系统，土壤环境极有利于其反硝化脱氮和N2O充分还原[4,17]。淹水状态下的稻田土壤具有很强的N2O消耗潜力，在前述试验过程中也发现淹水红壤水稻土0～5 cm土层对N2O消耗转化速率达到0.29～3.71 mg N/(h·kg)，但调控土壤N2O消耗能力的微生物机理并不清楚。此外，不同深度土壤生物、理化性质存在明显的分异。上层土壤容重一般显著低于下层土壤，分布着较多的土壤颗粒大孔隙，利于气体扩散和对流，但淹水后土层持水量则会高于下层土壤[46]，同时，土壤养分、微生物也被证明主要分布于土壤表层[47-48]，因此土壤反硝化能力以及N2O消纳能力在不同土层可能存在显著差异[49-50]。以主要耕作表层（0～10 cm）水稻土壤为应试对象，通过严格厌氧密闭培养的方法分别对0～5 cm、5～10 cm原状土壤进行外源N2O添加处理，探究不同土层深度水稻土壤N2O生物消耗能力和总消纳容量的差异，结果发现，淹水厌氧培养条件下，底部外源添加不同浓度N2O，0～5 cm和5～10 cm水稻土柱均能消耗97.11%～99.55%的N2O添加量，表明两土层均对外源添加N2O的消耗容量巨大。但两土层的消耗能力仍存在较大差异，0～5 cm和5～10 cm土层N2O的最大消耗率分别可达到1.99、1.30 mg N2O-N/(kg·h)，可见 0～5 cm 土层土壤N2O消耗转化能力显著高于5～10 cm土层，这与土壤含nosZ基因功能微生物的数量分布显著相关[51]。高浓度N2O添加会促进淹水土壤含nosZ基因的反硝化微生物数量增长，从而提高土壤N2O消耗能力。对稻田土壤N2O消耗能力及其机制的研究，可以为调控水稻田温室气体排放提供重要的科学参考。如何开发利用稻田土壤微生物资源，提高土壤N2O消耗能力，需要我们进一步探索。

2.5 水稻土N2O还原菌的筛选及功能差异机制研究

反硝化过程中，氧化亚氮还原酶催化的氧化亚氮还原反应是反硝化作用的最后一步，将N2O进一步转化为N2，是目前已知的N2O唯一的生物消耗过程[52]。稻田土壤中淹水条件的存在为N2O还原提供了良好的条件，有利于反硝化作用的彻底进行，从而以N2的形式释放气体，甚至消耗大气中的N2O，使稻田成为N2O的汇[53]。因此，稻田土壤N2O还原过程具有重要的研究意义。氧化亚氮还原酶由nosZ基因编码，含有nosZ基因、具有氧化亚氮还原作用的反硝化细菌，可称为氧化亚氮还原菌。目前的研究发现，nosZ基因具有nosZI和nosZII两个分枝，二者具有生态位分化[54]。且由于含nosZII基因的反硝化微生物有很大比例（约51%）不具备nirK或nirS基因[55]，因此对于N2O的消耗具有更大的贡献，目前很多研究认为含nosZII基因反硝化微生物在很大程度上决定了土壤作为N2O汇的能力[54-57]。但目前针对氧化亚氮还原菌展开的相关研究还较少，大部分研究主要集中在不同环境样品中氧化亚氮还原菌的群落丰度和多样性的比较[54,56,58]，缺乏对氧化亚氮还原菌作用机制的深入探究。因此，对氧化亚氮还原菌进行分离与鉴定，筛选出环境适应性强、N2O还原能力高的氧化亚氮还原菌，并对其N2O还原特性进行研究，对于该菌的实际应用，从而实现N2O减排具有重要意义。

利用微生物富集培养分离技术，从稻田土壤中分离得到了4株氧化亚氮还原菌，分别为Pseudomonas sp. DM15、Pseudomonas sp. DM22、Acinetobacter sp. DM24、Acinetobacter sp. DM27，根据不同试验条件下4株菌N2O的还原量的比较发现，Pseudomonas sp. DM15具有更强的N2O还原能力。对该菌的有效利用可能为减少土壤N2O排放提供新途径，实现微生物资源的有效利用[59]。

2.6 稻田N2O减排施肥技术研究

当前稻田的氮肥用量普遍偏高，减少氮肥投入是提高氮肥利用效率和降低稻田氮素损失的重要措施。但单纯的长期减少氮肥用量，可能会导致土壤肥力和水稻产量的下降。因此，稻田氮肥施用量的调控应基于稻田特殊的水分管理和施肥特征。由于稻田氮磷等养分流失较其他土地利用方式严重，且化肥撒施是导致稻田氮磷流失的重要原因之一，我们构建了基于化肥一次性深施的减氮控磷施肥技术[60]，并建立了双季稻减氮控磷长期定位试验。连续6年的田间试验结果表明，通过将双季稻化肥施用方式由表面撒施变为深施，可以减少30%的氮肥用量，每年可减少双季稻田氮肥投入量90 kg/hm2，同时将氮肥利用效率提高至44%左右，并且不会降低土壤有机质和全量养分含量，甚至提高土壤铵态氮、速效磷和速效钾含量，保持土壤肥力水平，从而使双季稻的产量增加5%～10%左右。除此之外，该施肥技术还可降低稻田表层水中70%～90%的铵态氮含量和20%～30%的总磷含量，每年减少双季稻田氮流失量9 kg/hm2，磷流失量0.15 kg/hm2，并且改变稻田N2O排放模式，降低稻田N2O的排放量。当地农户习惯在分蘖期施肥，导致N2O在该时期的大量排放，而氮肥减量深施处理除在双季稻返青期和成熟期略有N2O排放外，其余生育期间几乎无N2O排放。基于双季稻田减氮控磷施肥技术的研发，学科组在桃源县枫树乡开展了机械化大田示范。连续两年的试验结果显示，与当地的常规化肥撒施相比，该技术可以显著降低控制稻田表面水层的氮磷浓度，进而有效控制了氮磷损失，显著提高了氮肥利用效率[61]。因此，通过进一步的技术改进和理论探究，该施肥技术可以在我国南方双季稻田进行推广应用。但是，目前氮肥深施减少N2O排放的机理尚不明确，还需要我们进一步探索。

3 分子生物技术在稻田土壤N2O释放微生物调控机制研究中的应用

稻田土壤N2O产生、转化和释放的机制较复杂，参与的功能微生物种类繁多，新的分子生物技术手段的应用对于揭示其内在机理具有重要作用。近年来，稳定性同位素探针技术（Stable Isotope Probing，SIP）已成为研究土壤碳、氮循环，耦合微生物遗传多样性与功能多样性最有力的工具之一[62]。第二代高通量测序技术的发展和成熟，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测环境微生物群落结构随外界环境改变而发生的极其微弱的变化，对研究微生物与环境的关系、微生物资源利用有重要的理论和现实意义[63]。mRNA实时定量分析则可在基因表达水平预测功能基因的活性。在不同水平上分析转录组学、蛋白组学和代谢组学，有可能使硝化反硝化微生物的共生关系的机理研究取得突破性进展[64]。由于经典的16S rRNA方法已经不适合硝化、反硝化微生物的分子生态学研究，利用功能基因作为分子标记，研究根际土壤硝化、反硝化菌数量动态、群落结构、以及对氮素转化的影响受到重视[65]。以功能基因为靶基因，利用上述分子生物学技术，结合传统的土壤性质分析手段，有利于更深刻的揭示水稻土N2O产生和消纳过程的微生物作用机理，以及环境对其产生的影响。

4 研究展望

由于红壤的生态脆弱性及亚热带的气候特征，亚热带红壤区成为自然生态系统破坏与退化最严重的区域之一[66]，同时，亚热带红壤区充足的水热资源使其硝化反硝化过程较为活跃。综上所述，针对稻田N2O排放关键过程的微生物作用机理已经取得了初步的进展，未来的土壤微生物与氮素循环研究应重点从以下几方面开展：依托分子生物技术，从田块尺度或室内控制试验拓展到区域尺度，利用土壤微生物生物地理学理论和方法，深入解析亚热带红壤区土壤微生物时空分布特征及微生物群落构建机制；利用稳定性同位素示踪技术和新一代高通量测序技术，结合传统纯菌培养方法，在基因组和转录组水平构建农田土壤碳氮循环功能微生物分析平台；研究亚热带区不同空间尺度下土壤微生物的分布规律、土壤微生物与植物群落是否存在协同分布与共进化，解析土壤微生物分布与生态功能之间的关联机制；关注根系—土壤—微生物之间的协同机制以及植物—内生菌—土壤微生物之间相互影响的分子机制，解析土壤微生物在农田生态系统的功能及作用机制；关注土壤微生物对气候变化的影响，以及在气候变化背景下的响应过程，明确气候变化与土壤微生物的交互关系；还需加强对实用技术的研发、推广和示范工作，如硝化抑制剂、生物除臭剂、污水高效脱氮剂等，把基础研究成果转化为生产力，服务农业生产和生态文明建设。