猪肠道杯状病毒的病原学特征及检测技术研究进展

庄夕栋

（诸城市畜牧兽医管理局，山东 诸城 262200）

猪肠道杯状病毒（Porcine enteric caliciviruses，PECV）是引起猪病毒性腹泻的病原之一，它属于杯状病毒科，包括猪诺如病毒（norovirus，NoV）和猪札幌病毒（sapovirus，SaV）。猪NoV只感染成年猪，且无临床症状；猪SaV可感染各年龄的猪，以2～8周龄仔猪感染率最高，并引起仔猪腹泻[1]。PECV广泛分布于世界各地，给世界范围内的养猪业带来了一定的损失。

1 病毒的病原学特征

杯状病毒科（Caliciviridae）的病毒为无囊膜的单股正链的RNA病毒。病毒粒子直径为27～35 nm，含有长度为7～8 kb的基因组[2]。在通常情况下，杯状病毒在环境中较为稳定，病毒在高温下和某些化学物质（乙醚、氯仿等）作用下失活，PECV在pH 4.5～5.0的酸性条件下结构稳定。猪SaV可在猪肾传代细胞系（LLC-PK）和猪肾原代细胞中进行培养，该病毒是唯一能细胞培养的肠道杯状病毒[3]。猪NoV由于尚未找到合适繁殖的细胞系，对其理化性质和生物性能的研究还尚属空白。PECV能够体外培养，但必须在培养基里添加无菌猪肠道内容物或胆酸盐。后来研究证实，肠道培养物中的胆汁酸是病毒复制的活性因子，为猪肠道病毒在猪肾成纤维细胞系中复制所必需[4]。

2 病毒的分类地位

最新的病毒学分类将杯状病毒分为五个属，分别是诺如病毒属（Norovirus，NoV）、 札 幌 病 毒 属（Sapovirus，SaV）、水疱疹病毒属（Vesivirus）、兔病毒属（Lagovirus）和Nebovirus属[5]。属于水疱疹病毒属的猪水疱疹病毒（Vesi cular exanthema of swine virus，VESV）能够引起猪水疱疹，属于兔病毒属的兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic diseas e virus，RHDV）能够引起兔子致命的出血性疾病。

3 病毒的流行病学与致病性

猪NoV已经先后在日本、荷兰、美国、匈牙利、比利时、中国、韩国等国家检测出来。对NoV的流行有一项研究，调查了美国3个州（俄亥俄、密歇根和北卡罗来纳）的7个猪场和1个屠宰场不同日龄猪的NoV流行情况。这项研究共采集了621份粪便样品，RT-PCR检测的结果显示，这些猪场以及屠宰场中存在猪NoV的3种基因型，分别是GII-11、18和19。猪GII NoV只从育成猪（20～24周龄）猪群中检测到，总的流行率在20%左右[6]。不同猪场的流行率差异很大，流行率最高的猪场达70%。保育猪以及断乳仔猪（20周龄以下）未能检测到NoV，可能的原因是幼龄仔猪对NoV不易感，这同人类NoV感染类似。也有人指出，检测猪NoV的PCR引物是根据人NoV设计的，其灵敏性和特异性不高，在选择样品上也不够全面，未参考断奶前后的腹泻仔猪，因此NoV的流行情况和发病率可能比实际情况更高。

猪SaV广泛分布于世界各地。根据美国、荷兰等国家的研究都显示了各年龄段的猪群SaV的感染率和血清阳性率均明显高于NoV，且在不同国家的感染率不同，但通常是2～8周龄仔猪感染率最高。各种猪SaV分离毒株中，最常见的是属于GⅢ的SaV[7]。猪群中存在NoV和SaV共同感染的现象，发生腹泻的仔猪也可能与多种其他肠道病原体（冠状病毒、轮状病毒、星状病毒、嵴病毒和腺病毒等）混合感染，混合感染是否有协同作用而加剧腹泻还有待进一步的研究。由于存在隐形排毒以及母猪通过初乳中的母源抗体保护新生仔猪感染和发病，因此，环境中可能长期存在病原，病猪经粪-口传播途径可能是病毒传播的重要方式。

4 病毒的检测技术研究进展

4.1 直接电镜观察

病毒电镜（EM）观察可以直接观察到病毒粒子，但杯状病毒科包含的多种病毒在形态上差异不大，也很难将杯状病毒和其他肠道病毒如星状病毒、小核糖核酸病毒相鉴别[9]，因此对检测人员电镜观察的技术水平要求较高，电镜观察并不是一种常用的方法。

4.2 ELISA检测

ELISA可用于检测血清中的抗体水平，由于SaV病毒样颗粒（VLP）具有与真病毒相似的形态和抗原性，而绝大多数SaV缺乏细胞培养体系，因此重组VLP已被广泛用作抗体ELISA检测血清抗体的包被抗原。黄泽彬等[10]（2009）建立了PECV抗体检测的间接ELISA方法。用该法对湖南省各地区收集到的42份母猪和96份仔猪血清样品进行检测，PECV阳性率分别为83.33%（35/42）和 68.75%（66/96）。表明其所建立的间接ELISA方法适于大规模的PECV血清流行病学调查。

4.3 RT-PCR检测

目前RT-PCR是检测SaV的首选方法。Jiang等[11]（1999）基于RdRp基因设计一对引物：建立RTPCR方法，广泛应用于人和多种动物粪便或组织中NoV和SaV的检测。Martinez等[12]（2004）对委内瑞拉7个猪场204份0～9周龄的仔猪粪便样品进行RT-PCR检测，发现SaV 感 染 率 达 18%（36/204）。Jeong等[13]（2007）对韩国6个地区78个猪场的粪便样品进行RT-PCR和套式RT-PCR检测，SaV阳性率达29.1%（69/237）。黄泽彬等[10]（2009）对湖南地区多个猪场SaV感染进行流行病学调查，结果显示腹泻粪便样品中SaV阳 性 率 达 12.7%（24/189）。Valente等[14]（2015）用RT-PCR对巴西169份哺乳母猪、断奶仔猪、成年猪粪便样品进行了SaV检测，阳性率为23.7%（40/169）。陈燕君等（2016）根据猪NoV保守的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA Dependent RNA Polymerase，RDRP）基因序列设计了一套巢式RTPCR引物，建立了检测猪NoV的巢式RT-PCR检测方法。应用该方法检测某猪场健康育肥猪粪便样品，阳性率为54.5%。RT-PCR为PECV的诊断与监测提供了可供借鉴的方法，但上述报道的专门用于检测猪NoV和SaV的RTPCR方法，特异性和敏感性差别较大。

5 小结

目前对本病尚无特效治疗药物，主要靠加强饲养管理和卫生措施进行预防。可给发病猪口服葡萄糖盐水或复方葡萄糖溶液进行对症治疗。PECV感染将在今后很长一段时间内继续影响全球的养猪生产，而且该病毒为RNA病毒，具很大的变异潜力，易使病毒毒力增强，从而对养猪业和人们的健康造成更大的威胁，因而有必要做更深入的研究，以全面了解该病毒的流行病学和生物学特性，从而评价该病毒在引起仔猪尤其是断奶仔猪腹泻中所起的作用，进而合理地研制疫苗及制定疾病防控措施。综上所述，目前PECV的研究主要集中在流行病学方面。人们对PECV的入侵与感染、变异与迁移、免疫与致病、跨物种间感染与传播、暴发与流行等病原与宿主互作关系，以及病毒感染宿主的发生、发展和转归等规律的研究尚不深入。猪是PECV最主要的动物宿主，常以亚临床或隐性感染形式存在于健康猪群。此外，作为导致人与多种动物急性胃肠炎的主要病原体，动物源与人源PECV表现为遗传上高度同源性，不断有来源于人和猪的SaV重组新毒株被发现，均暗示猪可能具备“储存和整合”SaV的功能，具备潜在的跨物种间感染及传播给人的威胁，进而引发人兽共患病及相应的食品安全和公共卫生等问题，应引起足够重视。由于NoV和SaV的高度遗传变异特性和多样性及样品的质量和特异性扩增的条件和方法的限制，目前还没有一种方法能完全准确地检测到所有型别的PECV。当前，国内猪病流行形式十分复杂，各类新老疫病反复出现，有多种新出现的病毒从猪群中分离到。加强对猪NoV和SaV等新出现病毒的研究任重而道远。