细胞焦亡的研究进展

王星星，宋虎，杜晨阳 ，王振，张建军△

细胞焦亡最初被描述为鼠伤寒沙门氏菌感染的巨噬细胞的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase）-1依赖性细胞死亡，在体外［1］和体内均可发生［2］。1992年，Zychlinsky等［3］在志贺菌感染的巨噬细胞中观察到细胞死亡的裂解形式。这种细胞死亡最初被称为细胞凋亡，因为其与细胞凋亡具有某些共同特征，包括DNA片段化、核凝聚和caspase依赖性。后来，随着caspase-1依赖性细胞死亡的进一步表征，发现其与细胞凋亡不同。因此，在2001年，caspase-1依赖性细胞死亡被命名为细胞焦亡［4］。

1 细胞焦亡的机制和特点

细胞死亡程序包括凋亡、自噬、坏死以及焦亡。在形态学和病理生理学上，细胞焦亡与其他形式的细胞程序性死亡不同。如细胞凋亡通常伴随着细胞核固缩、核凝聚和核碎裂，以及通过形成凋亡小体（其在体内被驻留的吞噬细胞吞噬）。其特征在于细胞自主分解的活跃程序化过程，不会将细胞内容物释放到细胞外，且可有效抑制炎症。而细胞焦亡的特征在于快速的质膜破裂［5］，随后释放细胞内容物和促炎介质，包括白细胞介素（IL）-1β、IL-18和高迁移率族蛋白（HMGB）-1。它们对免疫应答反应有很多影响，包括促炎因子的转录诱导及T细胞和NK细胞分泌IFN-γ的作用增强。细胞焦亡是伴随着大量炎性因子产生的特殊程序性死亡［6］。有研究表明，细胞凋亡依赖caspase-3和caspase-6，而细胞焦亡是主要依赖于人、鼠caspase-1（或鼠caspase-11）为介导的细胞死亡途径［7-9］。caspase-1不参与凋亡性细胞死亡，caspase-1缺陷型细胞对大多数凋亡信号正常反应［10］。caspase-1的一个重要功能是活化IL-1β和IL-18［11］。感染伤寒沙门菌或志贺菌的巨噬细胞中存在caspase-1活化，导致这些细胞因子的激活和宿主细胞的死亡［12-13］。在细胞凋亡过程中，通过激活caspase活化的DNA酶（CAD）和降解CAD抑制剂（ICAD）发生核内DNA切割［14］。更重要的是，凋亡细胞中的线粒体外膜释放大量凋亡因子（apoptogenic）到细胞质中，包括细胞色素C和线粒体蛋白质（Smac/DIABLO）［15］。然而，在细胞焦亡过程中不会发生DNA梯度断裂和ICAD降解［16-17］。细胞焦亡是感染后的巨噬细胞产生的caspase-1依赖性细胞死亡，伴随着质膜通透性改变和核凝聚的炎症反应［6，9，18］。在巨噬细胞胞质溶胶中，伤寒沙门菌通过活化依赖于caspase-1诱导的细胞焦亡，促进IL-1β［8，18］的活化和分泌。由伤寒沙门菌感染的巨噬细胞和上皮细胞产生的促炎细胞因子在肠组织中引起强烈的炎症，由此可见，这种形式的细胞死亡的机制和结果明显不同于凋亡。

2 细胞焦亡的炎症通路

研究表明，人和鼠细胞焦亡均存在两种途径，细胞受到的刺激不同，所诱发的途径也不同，包括介导caspase-1活化的经典炎性小体和促进小鼠caspase-11活化和人类caspase-4和caspase-5活化的非经典炎性小体。在人类细胞中，caspase-4和caspase-5表现出与鼠caspase-11相同的功能［7］。介导细胞焦亡的炎症性caspase可被炎性小体激活［19］。caspase-1被各种经典炎症小体的配体激活，caspase-4，caspase-5和caspase-11直接识别细菌脂多糖，两者都引发细胞焦亡。

2.1 细胞焦亡的经典通路 细胞中的caspase-1以无活性的酶原形式存在，可通过与炎性小体结合而被激活，激活后形成具有酶活性的异二聚体，促进炎性因子成熟并释放。细胞焦亡在炎性巨噬细胞的质膜中迅速形成直径12～14 nm的孔［20］，导致细胞质溶胀和通过破裂渗透裂解质膜［21］，这些孔的形成需要caspase-1活化以及宿主细胞肌动蛋白细胞骨架的重排。caspase-1活化是通过炎性体诱导驱动的，促进蛋白水解成熟以及炎性细胞因子IL-18和IL-1β的活化和分泌，并裂解gasdermin D（GSDMD）以诱导孔开放［22-23］。IL-1β和IL-18在炎症和自身免疫性疾病的发病机制中发挥重要作用［24-25］。尽管细胞死亡过程中没有细胞因子的参与，但细胞因子的产生有助于细胞焦亡后继发的炎症反应［13，26］。质膜中caspase-1依赖性孔的形成与巨噬细胞中的细胞因子释放在时间上相关，表明细胞因子分泌通过这些孔发生［17］。

炎性小体是多种蛋白质信号复合物，其中心支架包括炎性小体 NLRP1、NLRP3、NAIP-NLRC4、AIM2和Pyrin［27］。每个炎性小体包含介导信号传导事件的caspase激活和募集域（CARD）或热蛋白结构域（PYD）。那些只有PYD的专用信号通过由PYD和CARD组成的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）适配器传递。ASC的CARD域通过CARD-CARD相互作用募集caspase-1，具有CARD结构域的信息传递组（NLRC4，NLRP1，NLRP1a，NLRP1b）可以通过 ASC或直接传递给caspase-1。对于含有CARD的炎性小体，细胞焦亡涉及ASC和caspase-1作用。与其他炎症引发传感器不同，NLRC4不具有N-末端的pyrin结构域，并且直接结合Ⅲ型细菌分泌系统的内部杆、鞭毛蛋白或针状蛋白，然后激活伴随IL-1β分泌的pyroptosis。丰富的IL-1β会增加ASC斑点的形成，并与辅助因子协同作用，促进模式识别，从而协助NLRC4信号传导［28-29］。

2.2 细胞焦亡非经典通路 caspase-11、caspase-4和caspase-5是非经典型炎性小体的关键组成部分，然而，其全部构成还不清楚。caspase-11、caspase-4和caspase-5通过直接与细菌脂多糖（LPS）结合被激活［30］。激活之前，必须通过Ⅰ型IFN或IFN-γ［31］启动caspase-11。LPS的脂质部分与相关caspase的CARD结构域的结合促进了它们的寡聚化和活化。据研究，caspase-11可通过不依赖于传统LPS、Toll样受体4（TLR4）的机制直接介导细胞死亡和IL-1α分泌［28］。同时 caspase-11 也可通过 NLRP3-ASC-caspase-1途径间接处理IL-1β，而使caspase-11缺陷的小鼠免受内毒素性休克。此外，caspase-11的表达可以诱导其自身激活，激活的caspase-11可以调节肌动蛋白细胞骨架动力学，这对于通过促进细菌空泡与溶酶体融合来限制细胞内病原体（如嗜肺军团菌）的生长可能有重要作用。

caspase-11诱导的细胞焦亡与胞质内细菌病原体的清除有关［32］。当LPS或IFN-γ处理巨噬细胞时，它们在鞭毛蛋白缺陷突变型嗜肺军团菌感染期间迅速经历caspase-11依赖性细胞焦亡［33］。然而，野生型嗜肺军团菌在体外感染用LPS预处理的巨噬细胞时可诱导caspase-11依赖性的细胞焦亡，可能是因为细菌局限于结构完整的稳定液泡并且不进入胞质溶胶所致。与caspase-1相似，对caspase-11功能的研究集中在巨噬细胞上。Lagrange等［30］证明，caspase-4检测人单核细胞中的LPS是组成性表达。这与髓样细胞中诱导的caspase-11相反，表明在人类中LPS介导的内毒素性休克不需要启动步骤。此外，caspase-4在角质形成细胞和上皮细胞中表达并诱导细胞焦亡，但在T细胞或前髓样细胞中不表达［30］。caspase-5 也能结合 LPS，并能重新形成caspase-11缺陷型的骨髓性巨噬细胞（bone marrow-deivedmaerophages，BMMs）焦 亡 ，但caspase-5在巨噬细胞中不表达。

3 细胞焦亡的分子机制

3.1 炎性小体及因子 目前已知的炎性小体是一种多聚蛋白复合物，包含在3个基因家族中：Nod样受体（NLR）、AIM2样受体（ALR）以及新鉴定的Pyrin炎性小体［34］。其中 NLRP1、NLRP3、NLRC4 炎性小体最为人熟知。NLR在识别引入宿主细胞胞质溶胶中的危险信号中发挥作用；TLR启动信号级联反应，导致细胞激活和产生炎性细胞因子，例如肿瘤坏死因子（TNF）、IL-6、IL-8和Ⅰ型IFN信号。NLR的核苷酸结合寡聚化结构域的NOD1和NOD2在配体识别后引发信号级联反应，类似于由TLR引发的级联反应，导致炎性细胞因子产生［35］。TLRs和caspase-1活化NLR通常与TLR刺激协同作用，导致对ATP治疗和耶尔森菌感染反应中NLR介导的caspase-1激活易感性增强。AIM2是一种主要定位于胞浆的蛋白质，其N端含有PYD，C端是寡聚核苷酸结合结构域。当双链DNA释放到细胞质后，AIM2可通过寡聚核苷酸结合结构域与双链DNA直接结合，而不与单链DNA结合，紧接着AIM2的PYD与ASC的PYD相互作用，诱导ASC的二聚体化以及炎性小体的组装，ASC再通过自身CARD招募caspase-1，从而激发先天性免疫反应。

3.2 caspase家族 尽管caspase家族的所有成员在氨基酸序列和结构上有相似之处，但它们的生理作用差异显著。caspases在触发细胞凋亡和细胞焦亡中发挥核心作用，但不参与其他程序性细胞死亡。可根据其生理作用和底物特异性对caspase家族成员进行分类，它们分为两大类：凋亡相关的蛋白（caspase-2/3/6/7/8/9/10），与caspase-1相关的蛋白（caspase-5/13/14）以及鼠与焦亡相关蛋白人鼠共有caspase-1（人类caspase-4/5及鼠类caspase-11/12）。凋亡启动蛋白（caspase-2/8/9/10）作为起始caspase主要负责启动半胱天冬酶活化级联。效应蛋白酶（caspase-3/6/7）通过切割细胞底物来参与细胞凋亡。凋亡启动蛋白的激活需要二聚化，其主要由caspase募集结构域或死亡效应结构域基序结合蛋白分子介导［36］。激活后，caspase-2/8/9/10通过级联方式活化下游效应蛋白酶来引发死亡信号［37］。效应蛋白酶通过内部Asp残基的蛋白水解转化为活性形式，形成由两个大亚基和两个小亚基组成的活性异源四聚体［36］。caspase-1是第一个被发现的IL-1β转换酶，被认为是炎症和细胞死亡途径的主要参与者。

3.3 GSDMD Lagrange 等［30］将 GSDMD 鉴 定 为caspase-1和caspase-4/5/11的通用底物。caspase切割GSDMD底物是细胞焦亡的关键执行事件［30］。Gasdermin是二联蛋白，其N-和C-末端结构域通过接头连接，并且在免疫相关疾病中具有重要的作用［38］。caspases-1或caspases-11裂解GSDMD，并释放N-末端结构域，然后与质膜的内部小叶结合并寡聚形成膜孔。这些孔隙的直径范围为12～14 nm，为IL-1β（4.5 nm）分泌到细胞外的重要途径。膜孔数量少时，IL-1β通过这些孔逸出量随之减少，少量的钠和水进入，此时轻度肿胀的细胞通过调节体积减少机制来抵消，防止膜破裂，稍后细胞可以通过正常的膜修复过程去除孔［39］。相反，当膜孔形成数量增多，细胞显著肿胀导致膜破裂，称之为细胞焦亡，并且从胞质溶胶中释放所有剩余的经过加工的IL-1β。GSDME是gasdermin家族的另一成员，最近的研究发现在GSDME高表达的化疗治疗细胞中表现出与GSDMD在孔形成过程中相同的功能，并将凋亡转换为细胞焦亡，该蛋白在肿瘤化疗药物的作用下，通过caspase-3的切割作用获得活性，诱导肿瘤细胞的细胞焦亡，并在化疗药物对正常组织的不良反应中扮演重要角色［40］。进一步了解GSDMD的作用机制可能为炎症性半胱天冬酶相关的自身炎症性疾病和感染性休克的治疗提供新的途径。

4 细胞焦亡在疾病中的发生发展

越来越多的证据表明细胞焦亡在免疫和疾病中起着重要的作用。细胞焦亡在感染过程中促进损伤细胞的死亡［41］，此外，还通过充当免疫细胞募集到感染部位的警报信号来促进病原体清除，进而有效保护机体。细胞焦亡可防止感染并诱发病理性炎症。一方面炎性小体可以诱导肿瘤细胞发生焦亡，抑制肿瘤细胞的增殖；另一方面，炎性小体的累积效应也可以形成适宜肿瘤细胞生长的微环境，起着促瘤生长的作用。因此，细胞焦亡在某种程度上是一把双刃剑。一方面，中度细胞焦亡有助于细胞稳态，并可有效地防止过度细胞增殖，这可能会保护宿主；另一方面，高水平的细胞焦亡可导致炎症，这不利于维持体内平衡。另有更多证据表明，在感染期间，细胞焦亡可以作为宿主有效的抗菌防御。

虽然caspase-1激活和细胞焦亡可以作为对感染性疾病的保护性宿主反应，但过表达或不适当的caspase-1激活和细胞焦亡可能是有害的。NLR蛋白的突变可导致不合适的caspase-1活化，其与遗传性自身炎症综合征相关［42］。此外，caspase-1参与包括心肌梗死、脑缺血、炎症性肠病、神经退行性疾病和内毒素性休克在内的多种疾病的发病机制，其中每一种疾病的共同特征在于炎症和细胞死亡。caspase-1缺陷或药理学抑制提供对与这些疾病相关的炎症、细胞死亡和器官功能障碍的保护，使得caspase-1成为有吸引力的治疗靶标。

细胞焦亡与各种感染性疾病关系密切。志贺杆菌、李斯特杆菌、绿脓杆菌、弗朗西斯菌属、嗜肺性军团杆菌以及耶尔森杆菌均被证实可诱导细胞发生细胞焦亡。caspase-1依赖的细胞死亡方式不仅存在于单核巨噬细胞系，还存在于树突状细胞等其他细胞中。诱导细胞产生caspase-1依赖细胞死亡的刺激原也不仅局限于病原体，一些非生物性的刺激源，如损伤相关模式分子（DAMP）、缺血坏死的产物等也可诱导细胞caspase-1依赖的细胞死亡。细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展，并发挥重要作用。对细胞焦亡的深入研究有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用，为临床防治提供新思路。